CXCL8及其受体 CXCR1、CXCR2在慢性乙肝患者外周血 PMNs中的表达
王健;韩忠燕;周娜
【摘 要】Objective:To study on the levels of CXCL8 and its receptors (CXCR1 and CXCR2) in peripheral blood neutrophils of the patients with chronic hepatitis B.Methods:The neutrophils were isolated and purified by neutrophil isolation medium,and the loads of HBV-DNA in neutrophils were detected by PCR,and the levels of HBeAg in rum were measured by ELISA.The patients were divided into different groups according to the detective results so that the expressions of CXCL8 and its receptors ( CXCR1,CXCR2) in neutrophils were detected by the methods of streptavidin-biotin complex ( SABC ) immunocytochemistry stain.Results:The data of SABC immunocytochemical stain showed that the positive color of CXCL8 was mainly located in the cytoplasm of PMNs.However,the most positive color of CXCR1and CXCR2 was mainly expresd in the cytoplasm and cell membrane.Interestingly,the deeper immune coloring of CXCL8 and CXCR1, and relatively shallow immune coloring of CXCR2 were explored in the group with
positive of HBeAg.The similar detective results also had been found in the cas with positive of HBV DNA in neutrophils.Compared with the normal control group,the levels of CXCL8 and CXCR1 in the patients were significantly incread ( P<0.05) ,but the differences were too small to be statistically significant in the level of CXCR2 (P>0.05).Conclusion:After neutrophils occult infected by HBV,not only the cretion of CXCL8 can be promoted, but also the expression of CXCR1 will be further incread.The data of immunohistochemical staining have been shown that the color degree of CXCL8 and its receptors ( CXCR1, CXCR2 ) are positive correlation to the level of HBeAg and the loads of HBV DNA.More PMNs can be chemotactic attraction to lesion so as to participate in the local inflammatory injury and tissue repair via the interactive pathway of the high expression of CXCR1 on surface of neutrophils with CXCL8.%目的：探讨慢性乙肝患者外周血中性粒细胞（ PMNs）上CXCL8及其受体CXCR1、CXCR2的表达。方法：以中性粒细胞分离液分离、纯化PMNs，检测患者血清HBeAg及PMNs内HBV DNA，入选患者依据检测结果进行分组，SABC免疫细胞化学染色法检测各组患者PMNs内CXCL8及其受体CXCR1、CXCR2的表达。结果：SABC免疫细胞化学染色结果显示， CXCL8主要
位于PMNs胞浆中，CXCR1、CXCR2多见于胞浆和胞膜上。其中HBeAg （＋）者CXCL8、CXCR1免疫着色较深，而CXCR2免疫着色较浅；PMNs内HBV DNA（＋）者CXCL8、CXCR1免疫着色亦较深，而CXCR2免疫着色亦较浅。患者CXCL8和CXCR1的水平均显著升高，与正常对照相比，差异均有显著性（ P＜0.05），而CXCR2的表达无统计学意义（ P＞0.05）。结论：HBV侵染中性粒细胞后可促进CXCL8分泌，使胞膜CXCR1表达进一步增强。 CXCL8、CXCR1、CXCR2免疫组化染色程度与患者HBeAg表达、HBV DNA载量密切相关。高表达CXCR1的中性粒细胞与CXCL8相互作用，趋化吸引更多PMNs至病灶，参与局部炎性损伤和组织修复。
【期刊名称】《中国免疫学杂志》
【年(卷),期】刘备打野2015(000)003
【总页数】6页(P375-379,383)
【关键词】水果拼盘作文慢性乙肝;中性粒细胞( PMNs);CXCL8;CXCR1;CXCR2;免疫细胞化学染色;卵白素-生物素复合物法
凤字开头的成语>李白号
【作 者】王健;韩忠燕;周娜
【作者单位】安徽理工大学医学院病原学与免疫学教研室，淮南 232001;安徽理工大学医学院病原学与免疫学教研室，淮南 232001;安徽理工大学医学院病原学与免疫学教研室，淮南 232001
【正文语种】中 文
【中图分类】R392.12
中性粒细胞(Polymorphonuclear neutrophils，PMNs)是人体最主要的一种白细胞，在介导抗病原微生物感染的非特异性免疫反应中起重要作用［1］。目前研究表明，PMNs 可表达CXCR1、CXCR2，其与CXCL8 相互作用可募集更多的中性粒细胞，从血管趋向炎症或损伤部位迁移，参与局部和全身的炎症反应［2-4］。为了解慢性乙肝患者外周血PMNs 上CXCL8 其受体CXCR1、CXCR2 表达，本文选择42例慢性乙肝患者外周血PMNs，以链霉亲和素-生物素复合物(Streptavidin-biotin complex，SABC)细胞免疫化学染色法检测其表达，并探讨其临床意义。
1 对象与方法
1.1 对象 所选病例均为我校附属医院和教学医院2011 年12 月至2012 年12 月收治的门诊及住院的慢性乙肝患者42 例，其中，男28 例，女14 例，年龄21～52 岁，平均(43.6±8.4)岁。HBeAg(+)患者17 例，HBeAg(-)患者25 例;PMNs 内HBV DNA(+)患者13 例，HBV DNA(-)患者29 例。入选患者均符合2010 年中华医学会推荐的慢性乙型肝炎防治指南诊断标准［5］。
1.2 试剂与仪器 中性粒细胞分离液购自灏洋生物制品科技有限责任公司;乙型肝炎标志物(HBsAg、HBsAb、HBeAg、HBeAb、HBcAb)诊断试剂盒购自上海科华生物股份有限公司;SuperReal PreMix(SYBR Green)试剂盒购自天根生化科技北京有限公司;鼠抗人CXCL8、CXCR1 及CXCR2 单克隆抗体购自LifeSpan BioSciences 公司;二抗、SABC试剂盒、显色试剂盒及苏木素等均购自武汉博士德生物工程有限公司;黏附载玻片及盖玻片均购自江苏世泰实验器材有限公司。5415D 高速离心机(德国Eppendorf 公司);EXL808 型酶标分析仪(美国Bio-Tek 公司);梯度PCR 仪TP600 购自日本TaKaRa 公司;MDF-135 型CO2培养箱(日本Sanyo公司);iCycle®荧光实时定量PCR 仪购自美国Bio-Rad 公司;Hema-2000 凝胶扫描分析系统购自珠海Hema 公司;Nikon-E400 荧光显微镜购自日本Nikon公司。
1.3 方法
1.3.1 PMNs 提取 取患者晨起新鲜外周抗凝血3 ml，小心置含3 ml 中性粒细胞分离液表面，室温2 000 r/min 常规离心35 min，见全血分为血浆、PBMCs 层、中性粒细胞分离液与PMNs 混合层、红细胞(Red blood cells，RBCs)层。弃血浆层和PBMCs 层，小心吸取中性粒细胞分离液和PMNs 混合层，以无Ca2+、Mg2+ HBSS 稀释至5 ml，混匀，重悬浮细胞;2 000 r/min 离心10 min，管底呈现红色团块，含PMNs 和残余RBCs。弃上清;加1 ml RBC 裂解液以裂解残余的RBCs，涡旋振荡数秒;1 500 r/min 离心5 min;弃上清;重复上述步骤，进一步清除残余的RBCs，加入250 μl 浓度为20 ml/L 的HBSS/HSA 重悬细胞，计数并调整细胞浓度至(1～2)×106 ml［6］。
1.3.2 PMNs 纯度、活度检测 取新分离、纯化的PMNs 以瑞氏染色镜检。镜下计数100 个细胞，中性粒细胞活度=中性粒细胞数/100 ×100%。用新鲜配制的0.4%台盼蓝染液和细胞悬液以1 ∶9 的比例混匀后3 min 内在显微镜下计数活细胞和死细胞，活细胞率(%)=活细胞总数/(活细胞总数+死细胞总数)×100%。所提PMNs 纯度＞95%，PMNs 活度＞95%。
1.3.3 血清HBeAg 及PMNs 内HBV-DNA 检测取患者血清及阴、阳对照样品各50 μl 分别与
50 μl酶结合物加至各自检测孔中，封板，37℃孵育30 min后甩去液体，每孔加1 ∶20 稀释的洗涤液200 μl，静置30 s 后甩干，重复3 次，扣干，各孔分别加显色剂A、B 各50 μl，摇床混匀，封板，37℃孵育15 min，各孔分别加终止液50 μl，空白孔调零，450 nm 波长下测各孔吸光度，记录结果，并依此结果将入选患者分为HBeAg(+)组与HBeAg(-)组。
腊肠怎么蒸好吃又简单分别取50 μl 上述PMNs 悬液和血清置于含50 μl SDS 裂解液的离心管中，混匀，沸水浴15 min，冰浴冷却5 min，12 000 r/min 离心3 min，取上清液2 μl 与10 μl 2×SuperReal PreMix、6.8 μl RNa-Free ddH2O 以及上下游HBV-DNA 引物各0.6 μl 混合，点动离心收集反应液后置于Bio-Rad 荧光定量PCR-iQ5 扩增仪上95℃15 min，95℃10 s，55℃30 s，72℃32 s，共40 个循环，检测PMNs 内HBVDNA，并依此结果将入选患者分为HBV DNA(+)组及HBV DNA(-)组。
1.3.4 SABC 法免疫细胞化学染色 取PMNs 细胞悬液涂片，待干燥后冰丙酮固定15 min;新鲜配制3% H2O2溶液中室温浸泡30 min，新鲜ddH2O 冲洗3 min×3 次;滴加50 μl 5% BSA，37℃孵育30 min后甩去多余液体;滴加50 μl 一抗(1 ∶400 稀释)，4℃过夜后37℃孵育1 h;PBS 洗3 min×3 次。滴加50 μl 生物素化的二抗IgG，37℃孵育30 min;PBS 洗3 min
×3 次，滴加50 μl SABC，37℃孵育30 min，PBS洗5 min×3 次;DAB 显色:取1 ml 双蒸水，加试剂盒中A、B、C 试剂各1 滴，混匀后每孔加100 μl，室温显色5 min。双蒸水洗涤，5 min×3 次;Mayor 苏木素复染30 s 左右，自来水及Na2HPO4溶液中各2 min;75%、85%、95% 和100% 无水乙醇下分别脱水3 min，干燥后中性树胶封片。其中阴性对照中用PBS代替一抗，阳性对照由LifeSpan BioSciences 公司提供。
正弦定理公式1.3.5 SABC 染色结果评判标准 以细胞涂片染色呈黄色作为阳性标准，参照Shimizu 等［7］判断标准，分别按染色深度及分布进行光镜分析并记分。根据细胞染色强度可分为4 级:0 分为阴性，蓝色;1分为弱阳性，浅黄色;2 分为中度阳性，黄色;3 分为重度，棕黄色;根据阳性细胞数占视野总细胞数的比例分为0 分为＜10%、1 分为10%～30%、2 分为31%～60%、3 分为＞60%，共4 级，最终评分值=阳性细胞比例评分值×染色程度评分值，总评分标准:小于3 分者为(-);3 至6 分者为(+);大于6 分者为(++)。新能源车销量
1.4 统计学分析 采用SPSS16.0 统计软件对数据进行分析，组间采用卡方检验或Fisher 确切概率法，P＜0.05 被认为差异有统计学意义，P＜0.01 为差异有显著性统计学意义。规定检验水准α=0.05;若总体有差异，修正检验水准α=0.016 7，进一步进行各个变量不同表
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达的两两比较，α＜0.016 7 为差异有统计学意义。采用GraphPad Prism 5 进行CXCL8及其受体CXCR1、CXCR2 mRNA 表达与血清ALT、CXCL8 之间相关性分析并作图。相关性分析:0＜| r |≤0.3 为微弱相关，0.3 ＜| r |≤0.5 为低度相关，0.5 ＜| r |≤0.8 为显著相关，0.8 ＜| r |≤1为高度相关。
2 结果
2.1 PMNs 纯度、活度检测结果 瑞氏染色镜检见获检PMNs 边界清晰，胞浆丰富，核分3～5 叶，叶与叶间有细丝相连，提示所提取纯化的PMNs 典型，可满足后续实验要求。见图1。
2.2 SABC 细胞免疫化学染色结果 SABC 免疫细胞化学染色结果显示，CXCL8 主要位于PMNs 胞浆中，CXCR1、CXCR2 多见于胞浆和胞膜上，其中HBeAg(+)者CXCL8、CXCR1 免疫着色较深，而CXCR2 免疫着色较浅;PMNs 内HBVDNA (+)者CXCL8、CXCR1 免疫着色亦较深，而CXCR2 免疫着色亦较浅(见图2、3)。
图1 中性粒细胞瑞氏染色Fig.1 Result of neutrophils with Wright's staining
图2 HBeAg(+)及HBeAg(-)者CXCL8、CXCR1 和CXCR2 染色结果(×1 000)Fig.2 Immunocytochemistry of CXCL8，CXCR1 and CXCR2 in HBeAg(+)and HBeAg(-)(×1 000)
图3 HBV DNA(+)及HBV DNA(-)者CXCL8、CXCR1和CXCR2 染色结果(×1 000)Fig.3 Immunocytochemistry of CXCL8，CXCR1 and CXCR2 in HBV DNA(+)and HBV DNA(-)(×1 000)
