TetR家族转录调控基因tfpA对链霉菌合成A21978C的影响
逄丽;魏维;靳旭;戈梅;陈代杰
【摘 要】目的 研究A21978C产生菌中一个TetR家族转录调控基因tfpA对A21978C产量的影响.方法 利用同源重组方法敲除该tfpA基因,HPLC检测突变株A21978C产量的变化,通过过表达与回补实验验证其调控特性.结果 敲除tfpA基因的突变株A21978C产量与亲株相比增加了50％;基因回补后A21978C产量恢复到亲株的水平.过表达突变株则几乎不产A21978C.结论 TetR家族转录调控基因tfpA对A21978C的合成至关重要,是一个负调控基因.非洲的气候
【期刊名称】童话里的故事>健康故事《中国抗生素杂志》
【年(卷),期】2015(040)005
【总页数】5页(P334-337,368)
【关键词】A21978C;TetR家族;转录调控子;基因敲除
【作 者】逄丽;魏维;靳旭;戈梅;陈代杰
【作者单位】华东理工大学,上海200237;上海来益生物药物研发中心有限责任公司,上海201203;上海来益生物药物研发中心有限责任公司,上海201203;上海交通大学药学院,上海200240;上海来益生物药物研发中心有限责任公司,上海201203;上海交通大学药学院,上海200240;上海来益生物药物研发中心有限责任公司,上海201203;上海交通大学药学院,上海200240;华东理工大学,上海200237
【正文语种】中 文
【中图分类】Q93
随着高致病耐药菌的不断出现，临床上对新型抗生素的需求十分迫切。达托霉素对包括MRSA、VRE等耐药菌在内的大多数的革兰阳性菌都有很强的抗菌活性[1]，已被FDA批准上市[2-3]，并显示出良好的市场前景。
达托霉素是A21978C的癸酰化衍生物。A21978C为多组分复合物，其中C1、C2、C3在发酵液中含量最高[4-5]，其结构见图1。A21978C是由玫瑰孢链霉菌(Streptomyces roosporus)通过非核糖体蛋白合成酶(NRPS)指导合成的[6]，我们从链霉菌HCCB10043
中分离获得了A21978C组分并发现其中含有与玫瑰孢链霉菌相同的长达128kb的合成基因簇[7]。之后利用RNA-q技术对A21978C高产菌株A9和低产菌株C4发酵培养48h的转录组进行分析比较，发现其中56个基因在A9中显著下调[8]，包括部分转录调控子。因TetR家族转录调控子是最常见的原核转录调控因子之一，调控一系列细胞活动，如：抗生素抗性、抗多药、细胞毒力与发育等[9]。本文以其中一个属于TetR转录调控家族的tfpA基因为对象，研究其对A21978C生物合成的影响。
1.1 菌种与质粒
论友谊链霉菌HCCB10043分离自土壤，由上海来益生物药物研究开发中心保藏；大肠埃希菌(Escherichia coli)ET12567/pUZ8002(上海生物工程研究中心)用作接合转移的供体菌；大肠埃希菌DH5α[天根生化科技(北京)有限公司]用于质粒转化的受体菌；pMD19-T simple vector[宝生物工程(大连)有限公司]；双功能温敏型穿梭质粒pKC1139(上海来益生物药物研究开发中心保藏)为大肠埃希菌-链霉菌穿梭载体、接合转移用载体，用于基因敲除实验；整合型穿梭质粒pLYW2(上海来益生物药物研究开发中心保藏)用于回补实验；具有接合转移起始位点oriT的多拷贝穿梭质粒pWMH3-oriT(中科院植生所惠赠)，用于过表达实验。
1.2 培养基和抗生素
培养基见参考文献[10]；萘啶酮酸购自上海生工生物工程有限公司；安普霉素购自上海维编科贸有限公司。
耳朵上长痣好吗1.3 重组质粒pLYPL141的构建
本研究中所用引物见表1。以HCCB10043总 DNA为模板，首先利用引物u1-F和u1-R PCR扩增获得tfpA基因的上游同源臂片段u1，再利用引物d1-F和d1-R PCR扩增tfpA基因的下游同源臂d1，然后将u1和d1平末端加A尾，分别连接到pMD19-T中得到重组质粒pMD19-T-u1和pMD19-T-d1，测序正确后，将pMD19-T-u1经Hind Ⅲ和BamHⅠ双酶切，而pMD19-T-d1经BamHⅠ和EcoRⅠ双酶切，回收相应u1、d1酶切片段，并与经过Hind Ⅲ和EcoRⅠ双酶切的载体pKC1139连接得到用于敲除tfpA基因的重组质粒pLYPL141。
1.4 重组过表达质粒pWMH-141与回补质粒pLYW-141的构建
无期是什么意思以HCCB10043总DNA为模板，利用引物p1F和p1R扩增获得含完整的tfpA基因片段p，再利用引物e1F和e1R扩增获得含完整的红霉素启动子片段erm，然后将p和erm分别克隆到p
MD19-T中得到重组质粒pMD19-T-p和pMD19-T-erm。其中pMD19-T-p经XbaⅠ和NdeⅠ双酶切，而pMD19-T-erm经NdeⅠ和XbaⅠ双酶切，回收相应p、erm酶切片段，并与经过XbaⅠ单酶切的载体pWMH3-oriT连接得到用于过表达tfpA基因的重组质粒pWMH-141；同时将p酶切片段与经过NdeⅠ和XbaⅠ双酶切的pLYW2载体连接，得到用于回补tfpA基因的重组质粒pLYW-141。
1.5 敲除突变株的构建与筛选
将重组质粒pLYPL141电转入E. coli ET12567/ pUZ8002感受态，然后接合转移入链霉菌HCCB10043[11]中，涂布于MS平板。28℃培养18h后覆盖安普霉素(抑制非接合子生长)和萘啶酮酸(抑制大肠埃希菌生长)溶液，3～5d后挑取接合子划线于安普霉素抗性MS平板37℃培养，由于pKC1139的温敏型复制子，在37℃时不能复制，迫于选择压力重组质粒pLYPL141依靠同源臂与宿主染色体发生同源重组整合到染色体上，从而获得单交换菌株。为通过双交换筛选基因敲除突变株，将单交换菌株接种到无抗TSB液体培养基中连续传代3次，稀释涂布于无抗的MS平板，28℃培养。挑取单菌落分别划线于安普霉素抗性和无抗的MS平板，筛选安普霉素敏感的双交换菌株提取染色体进行PCR验证。流程见图2。
1.6 过表达与回补突变株的构建与筛选
将重组的过表达与回补质粒pWMH-141与pLYW-141分别电转入E. coli ET12567/pUZ8002感受态，然后分别接合转移入链霉菌HCCB10043和LYPL141突变株中，MS平板28℃培养18h后，过表达菌株覆盖硫链丝菌素和萘啶酮酸溶液，而回补菌株覆盖安普霉素和萘啶酮酸溶液继续培养。3～5d后分别筛选硫链丝菌素抗性的过表达接合子和安普霉素抗性的回补接合子提取染色体进行PCR验证。
1.7 发酵与目标产物检测
收集HCCB10043及相关突变株的新鲜斜面孢子接种于种子培养基，28℃振荡培养42h；转种于发酵培养基，28℃振荡培养5d后，取发酵液加入等体积的无水甲醇混匀，然后离心取上清进行HPLC分析。HPLC条件为：色谱柱Hypersil C18柱(4.6mm×250mm，5μm)；流动相A：乙腈-0.5%(NH4) H2PO4缓冲液(10:90)，B：乙腈-0.5%(NH4)H2PO4缓冲液(45:55)，梯度洗脱(0～15min，A:B=25:75～0:100)；流速1.5mL/min；柱温35℃；进样量20μL。
2.1 敲除突变株LYPL141的获得
重组质粒pLYPL141经大肠埃希菌接合转移进入HCCB10043，通过单交换突变株筛选和无选择压力传代掉抗，获得对安普霉素敏感的tfpA基因双交换菌株，提取染色体利用短验证引物r1-F和r1-R进行PCR筛选验证。其中，以HCCB10043染色体为模板，PCR产物的理论大小为1526bp，回复突变株与其一致；而缺失突变株由于缺少了tfpA基因中间部分长度为775bp的片段，PCR产物的理论大小751bp。结果表明筛选获得了ΔtfpA突变株LYPL141(图3)。
2.2 回补突变株LYC141的获得
回补质粒pLYW-141经大肠埃希菌接合转移进入敲除突变株LYPL141，通过抗性选择压力获得对安普霉素耐受的菌株，提取染色体利用短验证引物Apr-F和Apr-R进行PCR筛选验证。结果表明获得了tfpA回补的C-tfpA 突变株LYC141(图4)。
2.3 过表达突变株LYOE141的获得
过表达质粒pWMH-141经大肠埃希菌接合转移进入HCCB10043，通过抗性选择压力获得对硫链丝菌素耐受的菌株，提取染色体利用短验证引物p1-F和p1-R进行PCR筛选验证。结果表明获得了tfpA过表达的O-tfpA突变株即LYOE141(图5)。
2.4 各突变株发酵分析
兴趣近义词亲株HCCB10043及相关突变株的发酵液HPLC分析结果见图6，A21978C产量统计结果见表2。结果表明：与亲株相比，突变株LYPL141中A21978C产量明显提高，而过表达菌株LYOE141几乎失去了产生A21978C的能力，回补菌株LYC141的A21978C产生能力得到了完全回复。
微生物次级代谢调控有3个层次：途径特异性、多效和全局调控[12]，研究次级代谢调控的分子机制将对利用代谢工程手段得到理想的天然产物和提高其产量具有极大的促进作用。Liu等[13]发现TetR家族转录调控基因SAV7471是通过结合SAV7471与SAV7472基因间区的两回文序列抑制SAV7472与SAV7473的转录，从而使阿维菌素的产量降低。Ou等[14]发现天蓝色链霉菌中TetR家族调控基因rrdA通过调控redD对十一烷基灵菌红素的合成进行负调控。最近，Ahn等[15]在链霉菌基因组范围内预测了TetR家族转录调控子的靶向基因，例如：天蓝色链霉菌中ActR(SCO5082)通过抑制ActA流出泵的转录来调控Act输出；AtrA(SCO4118)通过激活ActⅡ-ORF4的转录控制放线菌素的生物合成。但相比于这个家族调控子，大多数TetR家族基因的转录调控功能和机制还未知。本文通过同源重组的方式对
属于TetR家族的tfpA基因进行了基因敲除，发现tfpA敲除突变株A21978C产量与亲株相比增加了50%；将该基因回补入敲除突变株后，A21978C产量重新恢复至亲株水平；在亲株中过表达该基因后，A21978C产量与亲株相比明显降低；结果显示该基因是一个负调控基因，对A21978C的合成有很大的影响，但它是如何对A21978C的合成进行调控的仍需要进一步的研究。
【相关文献】
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