励志的说说(19)中华人民共和国国家知识产权局
(12)发明专利申请
(10)申请公布号 (43)申请公布日 (21)申请号 201711016027.X
(22)申请日 2017.10.25
(71)申请人 李晓菊
地址 401123 重庆市渝北区恒山东路5号附
7号12幢5单元2-1
(72)发明人 李晓菊 文良均
(74)专利代理机构 重庆晶智汇知识产权代理事
务所(普通合伙) 50229
代理人 李靖
(51)Int.Cl.
C12N 15/62(2006.01)
C12N 15/66(2006.01)
A61K 39/116(2006.01)
A61K 39/09(2006.01)
A61K 39/02(2006.01)
A61P 31/04(2006.01) (54)发明名称
一种融合基因及其在制备肺炎疫苗中的应
用
正大军区级(57)摘要
本发明融合表达了肺炎支原体P1和P30的优
势抗原区域P1a-P30a，并利用肺炎链球菌溶血素
PLY的基因与肺炎支原体P1和P30的部分基因融
合表达PLY-P1a-P30a，PLY-P1a-P30a蛋白的免疫
原性显著高于P1a-P30a的免疫原性，不仅增强了
肺炎支原体亚单位P1a-P30a的免疫原性，而且具写春节的诗词
有肺炎链球菌的免疫作用，对小鼠无临床观察的
毒性。融合基因PLY-P1a-P30a 是成本较低的基
因资源，PLY-P1a-P30a 融合基因的亚单位疫苗
表达量高，易于纯化和制备，可在-80℃保持2年
以上的稳定性和免疫活性，与常规的灭活疫苗和
弱毒疫苗相比制备成本显著降低，为肺炎支原体
和肺炎链球菌疫苗的研发奠定基础。权利要求书1页 说明书7页序列表4页 附图3页CN 107828810 A 2018.03.23
C N 107828810
A
1.一种肺炎支原体和肺炎链球菌的融合基因，其特征在于，其核苷酸序列如SEQ ID NO：5所示。
2.如权利要求1所述的肺炎支原体和肺炎链球菌的融合基因的构建方法，其特征在于：将肺炎支原体P1的部分基因P1a(3478-4047位碱基)与P30的部分基因P30a(311-792位碱基)通过Linker连接，然后与PLY基因融合得到PUC19-P1a-Linker-P30a和PUC19-PLY-Linker-P1a-Linker-P30a；分别将载体经NcoI和XhoI酶切，并分别连接到pET30a载体上，构建得到重组质粒pET30a-P1a-Linker-P30a和pET30a-PLY-Linker-P1a-Linker-P30a，
怎么才能写好作文
其中：
P1a基因的核苷酸序列如SEQ ID NO：1所示；
P30a基因的核苷酸序列如SEQ ID NO：2所示；
PLY基因的核苷酸序列如SEQ ID NO：3所示；
P1a-P30a基因的核苷酸序列如SEQ ID NO：4所示；
PLY-P1a-P0a基因的核苷酸序列如SEQ ID NO：5所示；
上述Linker的碱基序列为：GGCAGCGGCAGCGGCAGCGGCAGC。
3.权利要求1和2所述的融合基因在肺炎支原体和肺炎链球菌疫苗中的应用。
权 利 要 求 书1/1页CN 107828810 A
一种融合基因及其在制备肺炎疫苗中的应用
技术领域
[0001]本发明涉及医药生物技术领域，具体涉及一种肺炎链球菌与肺炎支原体基因的融合基因的制备方法与应用，肺炎链球菌溶血素及其作为免疫增强剂的制备与应用。
背景技术
钢铁侠导演
[0002]肺炎是发生在终末气道，肺泡和肺间质的炎症，为常见的呼吸道感染性疾病，一般由上呼吸道感染后未能得到彻底治疗或患者免疫力低下，引起炎症下行扩散所致。WHO统计数据显示(GURGEL R Q，BEZERRA P G，DUARTE MDO C，et al.Relative frequency，possible risk factors，viral codetection rates，and asonality of respiratory syncytial virus among children with lower respiratory tract infection in Northeastern Brazil[J].Medicine(Baltimore)，2016，95(15)：e3090.)，近年来，急性呼吸道感染的死亡率已仅次于心血管疾病，位居第2位，其中下呼吸道感染，是世界范围内导致儿童和老年人高发病率和高死亡率的主要因素，全球每年因肺炎死亡的儿童约190万～220万(陆兰翠.小儿肺炎支原体感染治疗的研究进展[J].中文科技期刊数据库(文摘版)医药卫生，2015，(4)：268-269)。人呼吸道感染中常见的病原体有肺炎链球菌、肺炎支原体、腮腺炎病毒和呼吸道合胞病毒等。(SONG Q，XU B P，SHEN K L.Effects of bacterial and viral co-infections of Mycoplasma pneumoniae in children：analysis report from Beijing Children's Hospital between2010and 2014[J].Int J Clin Exp Med，2015，8 (9)：15666-15674)，而大多数病毒已经有相应的疫苗，但截至目前，肺炎支原体(Mycoplasma pneumoniae，Mp)疫苗仍处于研究阶段。随着大环内酯类药物在临床的广泛应用，已有越来越多耐药菌株产生，且有不断增多的趋势(SAKAI T，ISHIDA T，ARITA M，et al.A study on the clinical cour and antimicrobial susceptibility of Mycoplasma pneumoniae in a community hospital[J].Kannshogaku Zasshi，2015，89 (4)：458-464)。因此，研发肺炎支原体和肺炎链球菌的疫苗对预防和控制肺炎有很重要的作用。
[0003]肺炎支原体肺炎占社区获得性肺炎的5％～40％，且主要引起青少年感染(Atkinson TP,Balish MF,Waites KB.Epidemiology,clinical manifestations, pathogenesis and laboratory detection of Mycoplasma pneumoniae infections[J] .FEMS Microbiol Rev,2008,32(6):956-973)。目前MP的灭活苗的预防效果仅有36％，(LINCHEVSKI I，KLEMENT E，NIR-PAZ R.Mycoplasma pneumoniae vaccine protective efficacy and adver reactions-systematic review and meta-analysis[J] .Vaccine，2009，27(18)：2437-2446)。由于减毒苗存在残留的毒力和致病性因素尚未在人体上使用，因此，目前主要研发的方向是亚单位疫苗。由于MP引起细胞损伤的第一步是黏附于宿主细胞表面，因此其疫苗研究的重点就在于抑制病原体的黏附。与MP黏附相关的表面蛋白P1和P30在其致病过程中十分重要，而且这两个黏附蛋白的编码基因均处于高度保守区域，在对这两种蛋白的相关研究中，SCHURWANZ等选取P1免疫原性最强的部分和P30融合
表达蛋白，将蛋白免疫豚鼠后得到接近于MP全菌体免疫豚鼠后血清的效果。(SCHURWANZ N，JACOBS E，DUMKE R.Strategy to createchimeric proteins derived from functional adhesin regions of Mycoplasma pneumoniae for vaccine development[J].Infect Immun，2009，77(11)：5007-5015)。虽然，针对P1和P30蛋白研发的亚单位疫苗安全性较好，但其并未保留一个较为完整的致病颗粒，普遍存在免疫原性较差的情况。
[0004]肺炎链球菌溶血素(Pne um o lys i n，PL Y)是肺炎链球菌(Stre pto co c c us pneumoniae，SP)
分泌的一种重要的溶细胞毒素。PLY是由471个氨基酸组成的分子量为53kDa的一种多功能蛋白。PLY在增强病原菌侵袭力的同时，可活化补体经典途径，诱导巨噬细胞和单核细胞等产生细胞因子，激活机体免疫系统，(Karmakar M,Katsnelson M,Malak HA,Greene NG,Howell SJ,Hi AG,Camilli A,Kadioglu A,Dubyak GR,Pearlman E.Neutrophil IL-1βprocessing induced by pneumolysin is mediated by the NLRP3/ ASC inflammasome and caspa-1activation and is dependent on K+efflux.The Journal of Immunology,2015,194(4):1763–1775)。因此PLY是肺炎链球菌疫苗的重点候选抗原，我们还利用它作为肺炎支原体抗原的免疫增强剂，不仅提高目前肺炎支原体疫苗的免疫能力，而且较大范围的预防肺炎。
发明内容
[0005]本发明的目的是提供一种有效的预防肺炎支原体和肺炎链球菌感染的融合基因的制备方法和应用。利用肺炎链球菌PLY蛋白的抗原性和免疫增强性，在预防肺炎链球菌的同时可以增强肺炎支原体的免疫效果。
[0006]本发明目的是通过如下技术方案实现的：
[0007]一种肺炎支原体和肺炎链球菌的融合基因，其特征在于：融合基因主要由PLY、P1a 和P30a三部分基因序列组成组成，PLY为肺炎链球菌溶血素基因序列，P1a和P30a分别为肺炎支原体P1和P30
基因的优势免疫区段，利用Linker把三者相互连接获得肺炎支原体和肺炎链球菌的融合基因PLY-P1a-P30a。
[0008]一种肺炎支原体和肺炎链球菌的融合基因的构建方法，其特征在于：将肺炎支原体P1的部分基因P1a(3478-4047位碱基)与P30的部分基因P30a(311-792位碱基)通过Linker连接，然后与PLY基因融合得到PUC19-P1a-Linker-P30a和PUC19-PLY-Linker-P1a-Linker-P30a。分别将载体经NcoI和XhoI酶切，并分别连接到pET30a载体上。构建得到重组质粒pET30a-
[0009]P1a-Linker-P30a和pET30a-PLY-Linker-P1a-Linker-P30a。
李斯特是哪国人[0010]其中：
[0011]P1a基因的核苷酸序列如SEQ ID NO：1所示；
[0012]P30a基因的核苷酸序列如SEQ ID NO：2所示；
[0013]PLY基因的核苷酸序列如SEQ ID NO：3所示；
[0014]P1a-P30a基因的核苷酸序列如SEQ ID NO：4所示；
[0015]PLY-P1a-P30a基因的核苷酸序列如SEQ ID NO：5所示；
关于树的名言
[0016]上述Linker的碱基序列为：GGCAGCGGCAGCGGCAGCGGCAGC。
[0017]本发明还包括上述PLY-P1a-P30a融合基因在制备肺炎支原体和肺炎链球菌疫苗
中的应用。
[0018]本发明的有益效果：1、本发明一种融合的P1a-P30a蛋白和PLY-P1a-P30a，PLY-P1a-P30a蛋白的免疫原性显著高于P1a-P30a的免疫原性，不仅增强了肺炎支原体亚单位P1a-P30a的免疫原性，而且具有肺炎链球菌的免疫作用，对小鼠无临床观察的毒性，为研制新型肺炎支原体和肺炎链球菌疫苗奠定了基础。2、融合基因PLY-P1a-P30a是成本较低的基因资源，基于PLY-P1a-P30a融合基因的亚单位疫苗表达量高(占到总蛋白的5％)，易于纯化和制备(纯化效率达到55％)，与常规的灭活疫苗和弱毒疫苗相比制备成本显著降低。3、融合蛋白PLY-P1a-P30a可在-80℃保持2年以上的稳定性和免疫活性。
附图说明
[0019]图1：是本发明的技术流程框图；
[0020]图2：是本发明中重组质粒pET30a-P1a-Linker-P30a的构建示意图；
[0021]图3：是本发明中重组质粒pET30a-PLY-Linker-P1a-Linker-P30a的构建示意图；[0022]图4：是本发明中的重组质粒pET30a-P1a-Linker-P30a和pET30a-PLY-Linker-P1a-Linker-P30a的原核表达和酶切胶图。图中标记说明：M：蛋白分子量；1：pET30a-PLY-Linker-P1a-Linker-P30a(BL21)未诱导；2：pET30a-PLY-Linker-P1a-Linker-P30a 37℃IPTG诱导5h；3：pET30a-PLY-Linker-P1a-Linker-P30a酶切；4：pET30a-P1a-Linker-P30a37℃IPTG诱导5h；5：pET30a-P1a-Linker-P30a 37℃IPTG酶切；
火龙果种植方法
[0023]图5：利用本发明制备的重组亚单位疫苗：P1a-P30a和PLY-P1a-P30a以及对磷酸盐缓冲液(PBS)免疫BALB/c小鼠后血清中的抗体水平的检测。
具体实施方式
[0024]实施例1：
[0025] 1.pET30a-P1a-Linker-P30a融合基因的构建
[0026]P1a-linker-P30序列以肺炎支原体M129菌株为序列模板，P1a和P30a分别选取M129菌株P1的3478-4047位碱基与P30的311-792位碱基，通过Linker连接，由生工生物工程有限公司合成于PUC19-P1a-Linker-P30a载体上，NcoI和XhoI酶切，并连接于pET30a载体上。
[0027]PUC19-P1a-Linker-P30a酶切体系如下表：
[0028]
[0029]pET30a载体酶切体系如下表：
