眼镜妆容
利用重组大肠杆菌生物合成左旋多巴
摘要：左旋多巴(3,4-dihydroxyphenyl-l-alanine, L-DOPA)是治疗帕金森氏病的主要药物，在保健美容等领域也具有广阔的应用前景。随着全球人口老龄化的加剧，左旋多巴的需求量也将逐渐提高。与从植物中提取或化学法合成相比，微生物酶法生物合成左旋多巴具有工艺简单、产量稳定等优点。酪氨酸酚裂解酶(tyrosine phenol-lya, TPL)是生物合成左旋多巴的重要酶。该酶可以催化邻苯二酚、丙酮酸钠和氨合成左旋多巴。
关键词：左旋多巴、生物合成、基因重组
1.1帕金森氏病与L-DOPA
左旋多巴又称L-多巴，为酪氨酸的羟化物，在体内是左旋酪氨酸合成儿茶酚胺的中间产物。左旋多巴一直是帕金森病治疗的金标淮。在帕金森症状的治疗中,左旋多巴比其他所有药物都更有效,这可能是由干其产物（多巴胺）是一种能同时作用于纹状体内两种多巴胺受体的生理性神经递质,而许多激动剂仅仅激活D2受体。引起异动和症状波动虽与应用左旋多巴有关,但其根本原因是黑质的严重破坏。未来左旋多巴新给药方法的思路包括应用药物的新剂型,如经皮钻贴剂、鼻腔喷雾剂、咀嚼片以及缓释剂等[1]。
L-DOPA的衍生物——多巴胺是一种重要的神经递质，由于多巴胺不能透过血脑屏障进入脑组织，所以不能通过补充多巴胺来治疗帕金森氏病，而L-DOPA可以通过血脑屏障，并在脑组织中脱羧形成多巴胺，从而使脑组织中多巴胺含量增加而达到治疗的目的。Birkmayer于1961年用左旋多巴治疗PD获得明显疗效[2]。L-DOPA及复方左旋多巴（如美多芭）已成为治疗常见老年病——帕金森氏病的主要药物[3,4]。
1.2 L-DOPA生产的国内外研究进展
和蔼可亲的近义词
1911 年，Casimir Funk 在实验室中第一次成功合成 D,L-DOPA。1913，MarcusGuggenheim从蚕豆的豆荚中第一次分离提取到天然存在于植物体内的 L-DOPA[2]。综合国内外研究状况，目前，L-DOPA 主要通过从植物中提取、化学法合成以及微生物酶法转化等方法生产获得。上世纪70年代初，国外化学法合成L-DOPA的年产量已达150吨，但由化学法所合成出来的产物是D-型和L-型的混合物，而D-DOPA会引起人体毒性反应[5]，因此应用于医学临床之前必须通过控制旋光度的方法来减少D-DOPA的影响。解决
此问题的最好办法是使D-型和L-型多巴完全分开，但D-型和L-型多巴的拆分非常困难。所以越来越多的研究者开始寻求新的L-DOPA获得途径。
1.3 生物合成L-DOPA
上世纪 60 年代，国外许多学者开始致力于微生物酶法合成L-DOPA的研究。Larway
和Evans首次在嗜酪氨酸微螺菌（Microspiratyrasinatica）中发现了与L-DOPA形成有关的酪氨酸酶[6]磅的组词。随后，John等在蜡状芽孢杆菌（Bucillus cereus）中也发现酪氨酸酶，并用来生产L-DOPA。为了提高L-DOPA产量和底物转化率，研究者们对微生物酶法合成L-DOPA的工艺方法进行了大量研究。酪氨酸酚裂解酶，又名β-酪氨酸酶，以磷酸吡哆醛为辅酶，TPL可以催化L-酪氨酸发生β-消去反应生成苯酚、丙酮酸和氨。由于这个反应是可逆的，将邻苯二酚代替苯酚后，可由邻苯二酚、丙酮酸和氨可在TPL催化下生成L-DOPA。近年来，随着分子生物学技术的发展，一些学者开始运用基因工程的手段从含有TPL基因的野生菌株染色体DNA中克隆得到TPL基因片段，将其连接到不同的载体上构建重组质粒，然后转入宿主细胞中进行表达。
图1.1 弗氏柠檬酸TPL活性位点
同时，研究者发现有些重组菌株虽然TPL的表达量高于野生菌株，但最终的L-DOPA合成能力却没有明显提高甚至低于野生菌株。这可能因为要获得较高的L-DOPA合成能力，菌株除了具备TPL高活性外，还要有相对完善的底物、产物出入细胞膜的转运机制以及对底物邻苯二酚抑制酶活的耐受力等[7]。
1.4全新表达型重组质粒pQTPL的构建
为了获得TPL 活性高、合成 L-DOPA 能力强的重组菌株，我们可以运用基因重组技术将TPL结构基因连接到带有强启动子的载体上构建重组表达质粒，使其在宿主细胞大肠杆菌中表达，后通过合成工艺的优化，以提高生物合成L-DOPA的产量。
首先我们用PCR的方法扩增得到弗氏柠檬酸细菌Citrobacter freundiiATCC8090中编码TPL的结构基因片段，并将其连接到带有T5启动子的载体pQE30上构建重组表达质粒pQTPL。然后将pQTPL转化E.coliM15，获得重组菌株E.coliM15(pQTPL)，通过对诱导培养条件的控制使重组菌TPL活性得以表达。质粒pQTPL的构建过程如图1.2 所示。
韶山奇闻
图1.2 重组质粒pQTPL的构建
1.5 结论
初中英语怎么学
研究人员通过实验摸索出在低温诱导14h后TPL活性最高。但低温培养过程耗能较大，处于要获得经济合理发酵条件的考虑，又着重考察了诱导时间对重组菌生物量及合成L-DOPA能力的影响。此外较佳的接种量可以保证菌体良好的生长，接种量大会因细胞生长代谢速度过快造成营养匮乏或溶氧不足，培养基中碳源、氮源主要供给菌体生长而使酶的正常合成无法进行。过小的接种量则会导致细胞在发酵前期生长缓慢，使发酵周期无谓延长，这是在工业生产中应该避免的。因而，需要确定一个较优的接种量。重组大肠杆菌属于兼性厌氧菌，培养过程中溶氧的大小对菌体的生长和酶活都有很大的影响，增大溶氧更有利于重组TPL的表达及个人申请营业执照E.coli M15(pQTPL)合成L-DOPA能力的提高。当装液量太少时，溶氧过大，菌体因生长繁殖速度太快而过早衰亡，以致影响酶活表达；但装液量太多会使培养基中供氧不足，溶氧减少，菌体生长代谢缓慢从而不利于生物量以及酶活的提高，进而L-DOPA合成能力也会显著降低。最终，我们得到如下结论经37℃培养2h后加入0.2 mmol/L的IPTG，于18℃诱导14h，重组 E.coliM15(pQTPL)可溶性酪氨酸酚裂解酶蛋白约占菌体
总蛋白的61%；TPL 比酶活为 28.86 U/mg 蛋白。在 L-DOPA 合成体系中，以细胞干重计的E.coli M15(pQTPL)合成 L-DOPA 能力达到 1.61 g/g cell。
参考文献：
[1] 雍伟哲 . 左旋多巴在帕金森病患者未来治疗中的作用 . 继续教育 ,2005,20(20):20
成功佛
[2] Hornykiewicz O. L-DOPA: From a biologically inactive amino acid to a successfultherapeutic agent. Amino Acids, 2002,23:65-70.
[3] 王新德 . 左旋多巴治疗帕金森病的回顾和展望 . 中华老年医学杂志 ,2004,23(2):129-131.
[4] Katzenschlager R, Lees A J. Treatment of parkinsion’sdia:levodopa as the first choice.J Neurol,2002,249(2):19-24.
[5] 《中华人民共和国药典注释》. 第二版,1990,481-482.
[6] Larway P, Evans W.C, et al. Biochem,1962,85:22.
[7] Katayama T, Suzuki H, Koyanagi T, et al. Cloning and Random Mutagenesis of theErwiniaherbicolatyrR Gene for High-Level Expression of Tyrosine Phenol-Lya.Appl.Environ. Microbiol., 2000，66(11)：4764-4771.
>明成祖仁孝皇后
