综述
从石蜡包埋组织中提取DNA及对PCR的影响
从多年存档的常规福尔马林固定－石蜡包埋病理标本中提取高质量DNA可以解决在短期内难以搜集到大量有用标本的难题。但在福尔马林固定过程中常常出现DNA降解，不易获得大分子量DNA，使绝大多数分子生物学实验受限，因此从福尔马林固定－石蜡包埋组织中提取高质量DNA 可以解决分子生物学实验过程中缺少实验材料的难题，本节就不同的提取DNA的方法、标本固定过程对PCR模板的影响、DNA提取各步骤应注意的事项及如何获得满意的PCR扩增结果进行综述。
第一节、固定液、固定时间对DNA模板的影响
DNA[1]。Gall 等用6种固定液固定脑组织，它们分别为：①含缓冲液的10%的福尔马林；
②1%多聚甲醛；③丙酮；④AMeX固定法；⑤Carnoy固定液；⑥Bouin固定液。然后以相同的方法提取DNA，用于扩增317bp的β-肌纤蛋白基因。发现第1、4、5种固定液中提取的DNA可以获得满意的扩增结果；而第2、3种固定液扩增效果较差；所有用第6种固定液固定的标本提取的DNA均未见特异性目的基因扩增条带[2]。其他报道也证明：就固定组织中提取的模板质量及PCR有效扩增而言，甲醛固定优于多聚甲醛、B5及Bouin氏液[3-5]，含缓冲液的10%[6]，而用AmeX 方法固定，不仅能保护在福尔马林固定过程中破坏的抗原，而且可以提取到大分子量的DNA进行Southern杂交。
此外固定时间也明显影响DNA的提取质量。Ohara等在室温下用市售的10%福尔马林溶液（终浓度为3.7%甲醛和1%甲醇）固定等量的MT-2细
胞，时间分别为4小时、1、4、10天、1个月。提取DNA后经0.8%琼脂糖凝胶电泳显示：细胞固定时间少于4天的，可以见到较明显的大分子量条带；而固定超过4天仅见碎小片段[6]。Roger10%福尔马林，将标本固定不同时间后（6、24、48、72小时、1、2、3、4周），提取DNA，用于C-K-ras基因（135bp）的扩增，发现：固定时间少于48小时，扩增效果无影响；固定72小时至1周，仅信号强度有些减弱；若超过1周则扩增效果明显减低[8]。对造成这种降解现象的说法不一，多数认为：福尔
而甲酸对DNA有较强的降解作用，故应缩短固定时间，避免使用陈旧的福尔马林。Isola等认为：组织固定后，造成核酸蛋白的广泛交联，使DNA和蛋白质形成牢固的复合物，易断裂成DNA 片段，故提取完整的DNA很困难[9]。Moerkerk等则证明：在福尔马林固定过程中，嘌呤基之间及碱基与组蛋白之间形成了以福尔马林为介体的甲基桥，造成DNA的交联，在包埋过程中易随机降解。这种不良结果很难预测，因为固定程序缺乏统一标准。这种随机降解现象不仅影响较大片段靶序列的PCR扩增效果，而且用限制性内切酶消化后，对大片段进行Southern杂交，很难获得杂交信号[10]。南京理工大学分数线
第二节、DNA提取各步骤注意事项
1 标本的选择
坏死组织从细胞内释放出各种酶，引起蛋白质和DNA的降解，并形成毒性产物，抑制PCR反应[11]充电速度
溶和大片纤维间质组织，是从石蜡包埋组织中提取PCR模板的关键。在冷冻新鲜组织和福尔马林固定石蜡包埋组织中均存在一些抑制PCR反应的物
始物的量有关，因此减少提取组织的量，可能有助于PCR扩增的成功[13]。
2 脱蜡
Gall等比较了不同的脱蜡时间（2×30分钟、2×60分钟、2×120分钟、过夜）对扩增317bp靶片段的影响，发现2×120分钟及过夜脱蜡均能得到满意的结果；2×60分钟脱蜡，得到的扩增特异带非常弱；2×30分钟脱蜡则未能扩增出特异片段[2]。因为石蜡的存在是一大障碍，若不能从反应液中彻DNA PCR扩增[12]。
1980年的一角纸币值多少钱3 去除核酸酶
共沉淀
在组织中核酸酶对DNA降解也起了重要作用[13]。因此在标本脱蜡后，蛋白酶K消化前，将其置于75℃水浴20DNA酶，避免DNA提取过程中被酶解，增加DNA产量，这是能否提取到高质量DNA的关键步骤之一[14]。
4 蛋白酶K消化
Kol等比较不同浓度蛋白酶K（分别为0.5、1、4mg/ml）在不同温度下（37℃、50℃）消化不同时间（4、16小时）所提取的DNA的量，表明：用4mg/ml的蛋白酶K，在50℃水浴16小时获得DNA量最多。在该浓度下（4mg/ml）增加消化温度（从37℃到50℃）比增加水浴时间（从4到16小时）能获得更多的DNA，而在低浓度下（0.5mg/ml或1mg/ml），延长水浴时间也很有效，但未发现提取DNA的量的多少与PCR有效扩增有关[15]。Isola等认为用多个（20-30片）5µm厚的石蜡切片，经3天蛋白酶K （0.3mg/ml）消化，能明显增加大分子量的DNA产量，其效果比用（1-3片）50µm厚的切片在高浓度蛋白酶K（3mg/ml）消化短时间为好。这可能与蛋白酶K消化能部分逆转由固定导致的交联现象有关[9]。但有研究表明：长时间蛋白酶K消化，使短片段增加，认为60℃水浴2小时最佳[12]。总之，蛋白酶K消化是很关键的一步，若未用，仅适于扩增100bp左右的小片段。充分消化后，应在95℃灭活分钟，以防止扩增时蛋白酶K对Taq酶的
影响。鸡群
5 酚、氯仿抽提与乙醇沉淀联想记忆
交替使用酚、氯仿这两种不同的蛋白变性剂，可以增加去除蛋白质的效果。有人认为：酚、、15]。而多数研究证明：在蛋白酶K充分消化后，经煮沸离心取上清液与经酚、氯仿抽提乙醇沉淀获得的DNA模板，PCR效果无差异[1、2、10、12]。而且该步骤较费时，易造成交差污染且又损失一部分DNA。
但它溶于TE缓冲液后，在4℃可保存8个月以上，在－70℃能保存5年，而前者在蛋白酶K消化后，应立即扩增，否则几个月后扩增效果不佳，这可能由于该标本贮存与－20℃，反复冻融易造成模板的断裂[1]。故检测大量标本，且又不需长期保留用煮沸离心法较为便利；当标本需要长期保留，该步骤不能省略，以保证扩增的特异性和重复性。
6 去除抑制剂
由于存在抑制剂，常导致PCR扩增失败[12、13、15]。但对其实质还未进行系统的调查。从An等的发现来看，其具有耐高温、蛋白酶不易灭活、不溶于有机溶剂、分子量小于10K道尔顿、无组织和种属特异性、在冷冻新鲜
、经福尔马林固有效地去除抑制剂，改善PCR的扩增效果[13]。
第三节、PCR扩增溶菌酶含片
PCR靶序列的选择，对能否扩增成功至关重要，由于福尔马林固定对DNA造成不可逆的降解，故随着扩增片段的长度的增加，PCR的敏感性反而下降。Ohara10%福尔马林固定等量的MT-2细胞不同时间后，提取DNA，扩增不同长度的靶序列发现：当扩增片段分别为233、321、499bp
的靶序列时，固定时间分别超过4天、4小时、30分钟后，PCR的敏感性就开始降低，而对于120bp左
右的片段，固定时间即使超过1个月，PCR 扩增也未受影响[6]。一些实验表明：300bp、15]。但当用pH值为7.010%的福尔马林固定24小时，经40个循环的扩增，317bp和720bp的扩增片段均清晰可见，而如果循环次数小于30次则扩增特异带很难见到[2]。由于包埋组织中某些固定剂对Taq酶有抑制作用，将DNA模板稀释是有意义的[4、15]。但如果模板量小于则扩增不易成功[13]。对于扩增结果不理想的，用嵌套式引物或二次扩增的方法，有助于稀释抑制剂，并增加PCR的特异性[15、16]。
肌肉跳动是什么原因综上所述，从石蜡包埋组织中提取DNA
10%福尔马林、Carnoy氏液、Amex方法固定组织、缩短固定时间，有助于得到大分子量的DNA。另外，为了提高PCR扩增的成功率，以下措施是有益的，如：选用小于300bp的靶序列、去除标本中坏死组织、减少提取组织的量、延长脱蜡时间、灭活核酸酶、蛋白酶K充分消化、用离心过滤以降低抑制剂的影响等。在固定液和固定时间适宜的条件下，如果扩增靶序列大于300bp应将循环次数增加至40次，如果结果不理想，最好选择嵌套式引物或二次扩增的方法，以增加PCR的特异性。
