Apr. 2021Vol. 42 No. 2
2021年 4月 第 42 卷% 第 2 期
首都医科大学学报
Jourmai of Capital Medical Uniwm/y
[doi : 10. 3969/j. issn. 1006-7795. 2021. 02. 011]
・脑缺血损伤的基础研究・
远隔缺血预适应对脑缺血再灌注损伤大鼠缺血半暗带区PERK/p-eIF2 "
通路及自噬的影响
杨楠 丁 锚闫峰师文娟黄语悠赵咏梅*
基金项目：国家自然科学基金(81971095,81620108011 )。This study was supported by National Natural Science Foundation of China ( 81971095 ,81620108011).
* Corresponding authos , E-mail : yongmeizhao@ hotmaiU com
网络出版时间：2021 -04 -12 15：51 网络出版地址：https ：//kns. rkd nemkcms/detaii/11.3662. R. 20210412. 1139.022. html
(首都医科大学宣武医院中心实验室北京市老年病医疗研究中心神经变性病教育部重点实验室脑血管病转化医学北京市重点 实验室，北京100053)
【摘要】目的研究远隔缺血预适应(/mote ischemic preconditioning, RIFC)对局灶性脑缺血再灌注大鼠缺血半暗带区自噬相
关蛋白Beclinl 、LC3B 以及内质网分子伴侣GRP78、内质网应激(endoplasmic reticulum stress , ERS )相关通路PERK/p-eIF2%的影
响，探讨RIPC 保护脑缺血损伤作用的相关机制。方法 将24只健康雄性Spmyue-Dawle/大鼠采用抽签法随机分为3组：假手术 (Sham )组、大脑中动脉梗塞(middle cerebral artery occlusion , MCAO )组和RIPC + MCA 0组。每组8只大鼠。采用改良线栓法制
备大鼠MCAO 再灌注模型，于缺血90 mb 后拔出线栓再灌注24 h &其中RIPC + MCAO 组在MCAO 之前，给予大鼠连续3 d 的
RIPC (采用夹闭双侧股动脉10 mm 开放10 mm ，每天3个循环的方法)。免疫荧光双标染色法检测再
灌注大鼠缺血半暗带区自
噬相关蛋白Betinl 、LC3B 以及GRP78、p-eIF2%的表达。结果1) Sham 组大鼠脑内偶见Beclinl 阳性细胞。MCAO 组大鼠再灌 注24 h 缺血半暗带区Beclinl 表达水平比Sham 组显著升高！P <0. 05)。给予RIPC 的脑缺血再灌注大鼠半暗带区Beclinl 的表
达水平比MCAO 组显著减少！P <0. 05) & Beclin1与神经元标志物NeuN 共定位。2) MCAO 组大鼠再灌注24 h ，脑缺血半暗带区
GRP78分别与Beclin1和LC3B 免疫荧光染色共定位。3) MCAO 组大鼠再灌注24 h ，脑缺血半暗带区Beclin1与p-eIF2%免疫荧
光染色共定位。Sham 组大鼠未见Beclin1和p-eIF2%双标阳性细胞，MCAO 组大鼠再灌注24 h 半暗带区可见大量Beclin1和
p-eIF2%双标阳性细胞。给予RIPC 后，缺血大鼠半暗带区Beclin1和p-eIF2%双标阳性细胞数目比MCAO 组明显减少(P < 0. 05)。结论RIPC 可能通过抑制ERS 相关通路PERK/p-eIF2%，减少神经元中自噬相关蛋白产生，避免神经元过度激活自噬，
发挥对脑缺血再灌注损伤的保护作用。
$关键词】 脑缺血再灌注；自噬;Beclin1 ； PERK/p-eIF2%；内质网应激
$中图分类号】R743. 3
Effeci of remote iscCemic preconditioning on PERK/p-eIF2"
patiway and autophagy in the penumbra of rain with focal cerebral ischemia/peperfusion injury
Yang Nan , Ding Mae , Yan Feng , Shi Wenjuan , Huang Yuyou , Zhae Yongm/*
(Central Laboratory , Xuanwu Hospital , Capital Medical University , Beijing Geriatric Medical Rearch Center , Key Laboratory )
Neurodegenerative Dias of' Ministry c) Educatioo , Bejing Key Laboratory of Translational Medicine foc Cerebrovascular Dias ,
Beijing 100053, China)+ Abstract ]
Objechvr To inves/gato the p/tective effect and mechanism of remote ischemic preconditioning ( RIPC ) on cerebral
ischemia inju/ via studying the expressions of autophayy-related protein Beclinl , LC3B and chaperone of endoplasmic reticulum GRP78 ,
as well as endoplasmic reticulum stress ( ERS) -related pathway PERK/p-eIF2% in the penumbra of rats with focal cerebral ischemic/
/pefusion. Methodt A total of 24 male Sprague Dawley rats were divided randomly into 3 g/ups : Sham g/up , middle cerebral arte/
occ,usoon ( MCAO ) geoup and RIPC+MCAO geoup , woih n =8 ooeeach geoup.A mode,ooMCAO wasonduced woih iheoniea,umona,
suiueemeihod.Theeaisundeeweni90 monuiesooMCAOand ihen weeeeepeeoud ooe24 h bywoihdeawa,ooiheooameni.Theeecycesoo
RIPChad been goeen iheeeiomesadayooe3 daysbeooeeiheMCAOsuegeey , onduced byiempoeaeoyocc,udongiheboaieea,oemoea,aeieeoes ( 10 monuies ) peooeio10 monuiesooeepeeousoon.Theposoioeeeipee s oonsooauiophagy-eeaied peoieon Becon1 and LC3 B , aswe ,as
GRP78 and p-eIF2% on iheoschemocpenumbeaooihebeaon io s uescioonsweeedeiecied woih ommunoouoeescencedoub esiaonong.
226首都医科大学学报第42卷ResdSs1)There was lutlv BecVnl positive cells in the Sham group.Compared with Sham group#the BecVnl positive cells in the
penumbra of MCAO group obviously incread after24h yperfusion(P<0.05).Compared with MCAO group#the BecVnl positive cell-decread significanUy in the penumbra of RIPC+MCAO group.The BecVnl positive cells were coloca/zed with NeuN,a general neuronal marker,in the brain ischemic penumbra.2)In the penumbra of MCAO group rats after24h repeWusion,G RP78was coloca/zed with BecVnl and LC3B,respectively,which was examined with immunoXuoyscence staining.3)In the penumbra of brain tissue of MCAO geoup with24h eepeeusion,Becein1wascoeocaeieed with p-eIF2%.No Becein1and p-eIF2%doubeepositieece e wasobeeed in the Sham group.Lots of BecVnl and p-eIF2%double positive cells were obrved in the ischemic penumbra of MCAO group Cter24h repeWusion.After treated with RIPC,the BecVnl and p-eIF2%double positive cells in the penumbra of the ischemia rats were significantly decread compared with that in MCAO group(P<0.05).Conclusion RIPC may inhibit endoplasmic reticulum stress(ERS)-related pathway PERK/LIF2%and reduce the expression of autophagy-related protein,a/eviate excessive activation of
neuronal autophagy,and thus exerts neuroprotective efects on cerebral ischemia/repeWusion injuy.
+Key words]cerebral ischemia/repeWusion；autophagy；BecVnl；PERK/p-eIF2%；endoplasmic reticulum stress
缺血性卒中占全部脑卒中的79%，具有高发病率、高致残率、高病死率的特点，是严重威胁人类健康的神经系统疾病之一，除在有限的时间窗内应用重组组织型纤溶酶原激活剂进行溶栓外，缺少有效的治疗和预防方法［1］o远隔缺血预适应（wmota ischemic pyconditioning,RIPC）是指通过对非重要器官的重复缺血/缺氧，显著增强其他远隔的靶器官或组织对缺血/缺氧的耐受能力。RVC不直接作用于靶器官，而是在其他非重要器官进行，避免了对重要器官（如脑和心脏）直接进行预适应可能引起的缺血风险。本课题组以往的研究［2-3］表明，RIPC对脑缺血再灌注损伤有神经保护作用，但相关作用机制尚不完全清楚。
自噬是真核生物中重要的胞内降解机制，在缺乏营养的生长环境或应激刺激下，细胞启动自噬。研究⑷显示，在脑缺血中自噬是一把双刃剑，既可加重脑缺血损伤，也可防治脑缺血⑷。轻度或中度的自噬激活能促进细胞生存，而过度的自噬激活则促进细胞死亡。Beclinl和LC3：均为自噬相关基因，参与了自噬体的形成［5］&本课题组前期研究［6］结果均表明，脑缺血再灌注损伤后，脑内BecVnl和LC3B的表达增高，说明脑缺血可导致自噬水平升高。应用自噬抑制剂3-MA可显著下调大鼠缺血区的自噬相关蛋白L.3
水平，缩小脑梗死体积，减轻脑损伤，说明抑制自噬过度激活可保护脑缺血再灌注损伤［7］&
有研究［8］表明，内质网应激（endoplasmic reticulum stress,ERS）对自噬有调控作用。内质网（ends plasmic reticulu叫ER）是蛋白质合成的重要场所，在细胞代谢和各种病理过程中起着关键作用。ER内环境平衡的破坏会导致ERS o ERS发生时，激活eIF2%的激酶蛋白激酶R样内质网激酶（peotein kina RENe ER kina,PERK）与ER分子伴侣GRP78发生解离,GRP78与ER内大量的未折叠蛋白结合，以协助其正确折叠，这一过程会触发未折叠蛋白反应（unfolded protein respon,UPR）&UPR的激活导致ER伴侣蛋白水平升高，激活包括PERK/eIF2%等信号通路［10］&ERS可以通过PERK/eIF2%信号通路激活自噬⑷&在小鼠胚胎成纤维细胞中，敲除PERK/ eIF2"基因可抑制ERS诱导的自噬，说明PERIK eIF2%信号通路对于ERS诱导的自噬是必需的［11］&研究［12］显示，心肌缺血再灌注损伤的保护作用是通过抑制自噬完成的，提示在脑以外的重要器官中抑制自噬过度激活可能是缺血再灌注损伤的潜在保护机制&但是，自噬是否参与RIPC的脑保护作用尚不清楚&因此，本研究采用后肢RVC方法对大鼠大脑中动脉梗塞（middle cerebral artey vcclusion, MCAO）再灌注大鼠进行保护，观察脑缺血大鼠再灌注24h后自噬相关蛋白BecVnl、LC3B以及ER分子伴侣GRP78和ERS相关蛋白p-eIF2%的表达，从而研究RIPC保护大鼠局灶性脑缺血损伤过程中PERK/p-eIF2%通路及自噬水平的变化，探讨RIPC保护脑缺血损伤的相关机制&
1材料与方法
11仪器及试剂
小动物呼吸机和麻醉机（Haward Apparatus公司，美国）、手术显微镜（Carl ZfN公司，德国）、反馈式温度调节仪（CMA150,Cawegia Medicin公司，瑞典）、双极电凝器（ACC100，北京德威医疗器械有限公司）、冰冻切片机（Thermv Fishar Scientific公司，美国）、荧光显微镜（Nikon公司，日本）&恩氟烷和水合氯醛购自河北一品制药公司，BaVinl、LC3B、GRP78、p-XF2%、NfiN抗体均购自美国CST公司&
第2期杨楠等：远隔缺血预适应对脑缺血再灌注损伤大鼠缺血半暗带区PERK/p-eIF2%通路及自噬的影响227
1.2实验动物分组及处理
健康雄性SD大鼠，体质量280-320g，北京维通利华实验动物公司，实验动物许可证号：SCXK（京）20129001。24只SD大鼠采用抽签法随机分为3组：假手术（Sham）组、MCA0组、RIPC+MCA0组，每组8只大鼠。饲养于SPF级动物室，自由进食进水。
1.3动物模型制作
1）RIPC[2]:RIPC+MCAO组进行RIPC。首先分离大鼠双侧股动脉，动脉夹夹闭双侧股动脉10mR，之
后松开动脉夹，再灌注10mix，构成一个循环，每天连续进行3个循环，连续进行3d。其余两组大鼠只切开皮肤后缝合。
2）MCAO模型制作:MCA0大鼠模型的制备依照改良Zea Longa法-13.。先在70%（体积分数）NO和30%（体积分数）。2中混合5%（体积分数）恩氟烷诱导麻醉，后改用2%（体积分数）恩氟烷维持麻醉。大鼠经颈部作正中切口，切开皮肤和皮下组织，分离右侧颈总动脉并夹闭，颈外动脉凝断后，将尼龙线栓自颈外动脉残端插进颈内动脉，至线栓顶端到达距颈总动脉分叉约1-8-2.0cm有阻力感处停止。缺血90min后，拔出线栓进行再灌注。逐层缝合肌肉、皮肤，再次消毒。术中监测大鼠各项生理参数在正常范围。手术成功后的大鼠提尾悬空时身体向正常侧弯曲[14]，模型制作失败后随即补充。
1.4免疫荧光双标染色
各组大鼠于再灌注后24h用水合氯醛腹腔注射麻醉，快速断头取脑，行脑组织连续冰冻切片（厚度约为20+m）,-80°C保存。取Sham组、MCA0组以及RIPC+MCAO组大鼠脑组织冰冻切片，于预冷的4%（质量分数）多聚甲醛中固定10min后，用0.2%（体积分数）TSmnX900破膜10mR，之后滴加5%（体积分数）的山羊血清室温封闭30mix，弃血清，之后分别滴加Beclin1与NeuN抗体！Beclin1抗体1：200稀释，NeuN抗体1：300稀释）、GRP78与BeclR1抗体（均1：200稀释）、GRP78与LC3B抗体（均1：200稀释），或BeclR1与p-eIF2%抗体（均1：200稀释）,4C孵育过夜。阴性对照不加一抗，
用PBS替代。次日将切片用PBS洗后，滴加荧光二抗（1:300稀释），室温避光孵育1h。PBS漂洗后，用含DAPI的封片剂封片。将封片后的切片置于荧光显微镜下观察大鼠脑皮质的缺血半暗带区[15]&在相同的放大倍数及参数下，每张脑组织冰冻切片随机选取4个视野照相，使用NIS Element软件统计阳性细胞数目&
1.5统计学方法
采用SPSS22.0软件进行统计分析，符合正态分布的计量资料以均数土标准差（表示，组间均数比较用单因素方差分析，两两比较采用LSD检验，以P<0.05为差异有统计学意义。
魅力女神英文
2结果
2.1RIPC抑制MCAO大鼠缺血半暗带区Beclin1
的表达
免疫荧光双标染色结果显示，在MCAO大鼠脑缺血半暗带区内可见BeclR1阳性细胞及NeuN阳性细胞，其中B e clR1阳性细胞为绿色荧光，NeuN阳性细胞为红色荧光，所有细胞的胞核为蓝色荧光。图像合并后，绿色与红色荧光重合，表明Beclin1与神经元共定位（图1A），即脑缺血再灌注后Beclin1在大鼠缺血半暗带区神经元内表达。
Sham组没有缺血半暗带区，其与缺血半暗带相对应的脑区内偶见B e clR1绿色荧光阳性细胞,MCAO 组大鼠再灌注24h，缺血半暗带区可见大量Beclin1绿色荧光阳性细胞,RIPC+MCAO组大鼠缺血半暗带区Bvclin1阳性细胞数量较MCAO组明显减少（图1A），三组间BeclR1阳性细胞数量差异有统计学意义（P<0.05）。两两比较结果显示，MCAO组BeclR1阳性细胞较Sham组明显增高！P<0.05）,RIPC+MCAO 组Bvclin1阳性细胞较MCAO组明显减少，差异有统计学意义（P<0.05）（图1B）。
2.2MCAO大鼠缺血半暗带区GRP78分别与Bec-
lic1和LC3B共定位
免疫荧光双标染色结果显示,MCAO组大鼠再灌注24h脑缺血侧半暗带区内，GRP78阳性细胞呈绿色,Beclin1和LC3B阳性细胞均呈红色，胞核呈蓝色。合并图像发现，绿色荧光与红色荧光重合，表明GRP78分别与Beciin1和LC3B共定位，提示在缺血再灌注后，自噬相关蛋白Beclin1和LC3B表达的上调与ER分子伴侣GRP78相关（图2）&
2.3MCAO大鼠缺血半暗带区Beclic1与p-eIF2a世界上最大的剑齿虎
共定位，且RIFC抑制MCAO大鼠缺血半暗带名字繁体
区Beclin1和p-eIF2"双标阳性细胞的表达
通过免疫荧光双标染色可见,MCAO组大鼠再灌注24h缺血侧半暗带区内，呈红色荧光的阳性细胞是Beclin1，呈绿色荧光的阳性细胞是p-eIF2%，蓝色标记
228首都医科大学学报第42卷
图1免疫荧光双标染色法检测脑缺血再灌注后24h Sham、MCAO与RIFC+MCAO组大鼠脑缺血半暗带区
Beclin1与NeuN的表达
Fig.1Expression of Beclin1and NeuN in cerebral ischemic penumbra of Sham,MCAO and RIFC+MCAO groupt after24h reperfusion whid was examined with immunofuorescencc double staining
A:A reprentative double immuno—uorescence staining showed the colocalization of Beclin1(green)and NeuN(red)in the ischemic penumbra of MCAO rats.Scale bar=20+m.B:quantification of Beclin1positive cell.Data are means±SD(n=5).*P<0.05es Sham g/up,#P<0-05es MCAO g/up；MCAO:middle cerebral afe/occlusion；RIFC:remote ischemic precon
ditioning；DAP【：4Z,6-diamidino-2-phenylindoic
图2脑缺血大鼠再灌注24h后半暗带区GRP78分别与Beclin1和LC3B共定位Fig.2GRP78was colocalized with Beclin1and LC3B respectively,whid was examined with immunofuorescencc staining in the ischemic penumbra of MCAO group rats after24h reperfusion
A reprentative double immuno—uorescence staining showed the colocalization of GRP78(green)with Beclin1(red)and LC3B(red)respectively in
the ischemic penumbra of MCAO rats.Scale bar=20|±m.MCAO:middle cerebral afe/occlusion；DAP【：4Z,6-diamidino-2-phenylindole.
的是细胞核。合并图像发现，绿色荧光与红色荧光重合，表明Beclin1与p-eIF2%共定位（图3A），提示在脑缺血再灌注后，自噬相关蛋白Beclb1的表达上调与ERS相关蛋白p-eIF2%相关。
Sham组大鼠没有缺血半暗带区，其与缺血半暗带相对应的脑区内未见Beclb1和p-eIF2%双标阳性细胞。而MCAO组、RIFC+MCAO组大鼠缺血半暗带区可见Beclb1和p-eIF2%双标阳性细胞（图3A），三组间Beclin1和p-eIF2%双标阳性细胞数量差异有统计学意义（PV0.05）&两两比较结果显示，MCAO组Beclb1和p-eIF2%双标阳性细胞较Sham组明显增高（P<0.05），RIFC+MCAO组Beclb1和p-eIF2%双标阳性细胞较MCAO组明显减少，差异有统计学意义（P<0-05）（图3B）。
3讨论
缺血适应作为脑缺血损伤的有效保护策略，近年来引起人们的广泛关注，在机体重要器官进行缺血预适应难度较大，且易形成致死性缺血，故不宜被临床采用。本课题组前期研究-16.显示，采用远端肢体进行缺血预适应，对脑或其他重要器官也同样具有保护作用，且更适合向临床转化。因此，深入研究RIFC
对
第2期 杨 楠等：远隔缺血预适应对脑缺血再灌注损伤大鼠缺血半暗带区PERK/p-eIF2%通路及自噬的影响
229
*
Sham MCAO RIPC
4
3
2 1 00 0 0 0 0
S =
CD
。
CD A
s s o d I d v d /
bn
u -a -s l s
3qnop
loeql
CD
d
pue -u
二o cd qq j o 图3 免疫荧光双标染色法检测脑缺血再灌注后24 h Sham 、MCAO 与RIFC+MCAO 组大鼠脑缺血半暗带区Beclin1与
p-eIF2"的表达
Fig. 3 Expression of Beclin1 and p-eIF2" in cembral ischemic penumbra of Sham , MCAO and RIPC + MCAO groups rats
after 24 h reber^ilsion which was examinee with immunofluorescence double staining
A ： A reprentative double immunoyuorescencc staining showed the colocalization of BecVnl (red) and p-eIF2% (green) in the ischemic penumbra of MCAO
rats. Scale bar =20 pjn. B : quantification of BecVnl and p-eIF2% double positive cells. Data are means ± SD ( n =5 ) . * P <0. 05 e Sham group , #P <
0.05 vs MCAO group ； MCAO : middle cerebral artey occlusion ； RIFC : remote ischemic preconditioning ； DAP 【：4Z ,6-diamidinc-2-phenylindolv.
脑缺血的保护作用并探讨其相关机制，对临床应用哈布洛先生
RIPC 治疗缺血性脑血管病具有重要意义。本文旨在
探究RIPC 对局灶性脑缺血损伤大鼠再灌注后24 h
缺血半暗带区自噬水平的影响，以及RVC 是否通过
抑制PERK/p-eIF2%通路，从而避免自噬过度激活，产
生脑保护作用，进一步明确RVC 发挥神经保护作用
的具体机制。
自噬是机体的一种防御性反应，适度自噬具有维
持细胞稳态和促进细胞生存的作用，但自噬的过度激 活则可导致细胞死亡。BecVnl 在自噬的起始阶段具
有重要作用，并且能够促进LC3的形成以启动自
噬-17.&研究-⑻表明，在大脑缺血再灌注几小时后，自苹果怎么锁屏
噬相关蛋白表达就开始上升。为了探究RIPC 对脑缺 血再灌注后自噬的影响，本研究检测了 RVC 对各组 大鼠缺血侧脑组织自噬相关蛋白BecVnl 的表达。研 究结果显示，与Sham 组相比,MCAO 组大鼠脑缺血再
灌注后24 h 缺血侧脑组织自噬相关蛋白BecVnl 表达
水平明显升高，表明脑缺血再灌注诱导BecVnl 过量 产生，自噬被过度激活。通过将BecVnl 与NeuN 进行
免疫荧光双标染色发现，自噬相关蛋白BecVnl 与神
经兀共定位，说明缺血再灌注后Bec Vn1在缺血半暗 带区神经元内表达增多，提示此时神经元发生过度自
噬，这可能是造成脑缺血神经元损伤的主要原因之 一。本课题组前期的研究-16.结果表明，给予RVC 处
理的MCAO 大鼠神经功能评分明显降低，脑梗死体积
明显减小。而本研究结果显示，予以RVC 的MCAO
大鼠脑缺血半暗带区自噬相关蛋白 Becein1 表达水平 明显下降。因此,RVC 对脑缺血再灌注损伤的保护
作用很可能是通过减少BecVnl 产生，进而抑制神经 元过度自噬实现的。有研究-⑼报道，联合应用RVC
和缺血后适应可通过抑制自噬保护脑缺血大鼠， 而本
研究则证明单独应用RVC 可通过抑制神经元自噬,
发挥脑保护作用。
LC3作为自噬体形成的标志，与自噬空泡形成的
数量有关，代表自噬的活性程度。LC3有3种不同的
亚型！LC3A 、LC3B 、LC3C )，通常检测组织中LC3B 蛋 白的含量代表组织内LC3的表达量-20.。最近研 究-21.显示,ER 分子伴侣GRP78的表达上调可以激活
孕妇能不能吃瓜子自噬，而GRP78的缺失可抑制ERS 诱导的自噬激活,
说明GRP78很可能是ERS 和自噬激活中的桥梁蛋 白。本研究选取缺血再灌注24 h 大鼠脑组织进行免
风险投资案例
疫荧光双标染色，结果显示，GRP78分别与自噬相关
蛋白Beclin 1和LC3B 共定位，提示在缺血再灌注后自 噬相关蛋白BecVnl 和LC3B 的产生与ERS 有关,ER 分子伴侣GRP78的产生很可能诱导自噬过度激活。
ERS 导致的UPR 反应可激活PERK/eIF2%信号
通路，进而引起自噬激活-10.&文献-11.报道，依赖
PERK 的eIF2%磷酸化可诱导小鼠胚胎成纤维细胞自
噬，敲除PERK/VF2"基因可抑制ERS 诱导的自噬。 本研究结果显示,ERS 相关蛋白p-eIP2%可与自噬相机动车信号灯
关蛋白Beclin 1共定位，提示在脑缺血再灌注后自噬
的过度激活与ERS 相关蛋白p-eIP2%有关，该结果进
