匍匐翦股颖HSP26.7基因启动子的表达分析魏佳兴，朱俊飞，董康挺，王亭亭，秦玉娇，郭琦，魏雨佳，
李军霖，边秀举，孙鑫博
(河北农业大学农学院/河北省作物生长调控实验室，河北保定071000)
摘要：为研究匍匐翦股颖HSP26.7基因启动子在植物抗逆方面的功能，克隆了匍匐翦股颖的一个小热激蛋白HSP26.7基因的启动子并进行了序列分析；构建了同时具有该启动子序列和GUS报告基因的植物表达载体，并通过农杆菌侵染法转化拟南芥植株。结果显示：该启动子存在HSE,ABRE等响应高温和其他胁迫的调控元件，受高温胁迫强烈诱导，且该启动子活性在生殖器官中较高。推断HSP26.7基因可能参与了植物高温胁迫的响应和生殖器官的发育过程。
关键词：启动子；小热激蛋白；匍匐翦股颖
中图分类号：S68&4文献标志码：A
DOI：10.p.2021.01.008
文章编号：1009-5500(2021)01-0055-06
热激蛋白(Heat-Shock Protein,HSP)是生物在逆境胁迫的情况下(如干旱、高温等不良环境)，体内才开始合成或合成量急剧增加的具有分子伴侣活性的调节蛋白质「一幻。植物体内的一些功能蛋白在逆境条件下常导致高级构象被破坏，从而影响蛋白质功能，最终影响生物的生理代谢分子伴侣虽不具有催化活性，但能协助失活蛋白重新恢复活力，构建正确的高级结构，从而减少不良环境引起的蛋白变性对生物体的影响⑷。因此，热激蛋白是植物对抗逆境的重要蛋白质。根据热激蛋白分子量的大小，热激蛋白可分为HSP100、HSP90、HSP70、HSP60以及sHSP5大家族］r。小热激蛋白(sHSP)是热激蛋白中的一个重要家族，虽然其分子量较小，但种类丰富，在植物体内普遍存在⑺。研究发现热激蛋白均对高温胁迫具有敏
收稿日期：2019-12-23；修回日期：2020-04-20
黄河诗歌基金项目：河北省自然基金优秀青年项目(C2018204056)；
大学生创新创业训练计划项目(2019110)；国家
自然科学基金(31701955)
作者简介：魏佳兴(1996-)，男，河北无极县人，主要从事草坪草遗传转化的研究-
E-mail：
孙鑫博为通讯作者。
E-mail：nik: 感性［1\小热激蛋白的表达不仅限于高温诱导，且一个亚家族的小热激蛋白的表达方式与效应蛋白也不尽相同。除了受外界环境诱导外，许多小热激蛋白的表达还具有时空特异性，即在植物不同的发育阶段，小热激蛋白的表达量也表现出明显的变化。
匍匐翦股颖(Agrostis stolonifera)是一类性状优良的多年生冷季型草坪草，耐阴能力较强，具有一定的耐践踏以及耐低修剪能力，常被用作高尔夫球场的果岭草，当修剪至3~5mm高度时可以形成高质量草坪；耐寒但不耐热，在绝大多数北方地区可安全过冬，但在河北省一些地区常出现“夏枯”现象，极大地影响了草坪的使用功能以及维护成本［10\在匍匐翦股颖热激蛋白的研究中发现较为抗热的品种往往要比不抗热品种多出1~2类热激蛋白［11\南京农业大学黄炳茹课题组对热激蛋白的研究已经有了一定的成果［12］，但是目前对匍匐翦股颖中小热激蛋白启动表达的信息传递方式以及与下游蛋白互作的具体模式尚不清晰。因此还需从微观领域进一步研究小热激蛋白的具体构造以及功能。Luo Hong课题组在匍匐翦股颖抗非生物胁迫的研究中鉴定出3个sHSPs：AsH-SP17,AsHSP26.7和AsHSP26.8。前期的研究表明, AsHSP26.7的表达受到高温胁迫的诱导，并且分别在过表达水稻SUMOE3连接酶基因OsSIZl和转水稻mu:roRNA393的转基因匍匐翦股颖中的表达有所增
加，且转基因植株的抗热性都有所增加［13-15］。因此，
AsHSP26. 7基因在匍匐翦股颖响应高温胁迫中起着
重要作用。然而，目前尚未发现对于AsHSP26. 7启 动子的研究报道。
本试验通过基因克隆得到HSP26. 7的启动子序 列，并进行启动子顺式作用元件分析、转基因拟南芥
GUS 组织化学染色和转基因拟南芥胁迫后的表达分
析，来阐述该基因启动子的表达模式，从而为探讨
HSP26. 7基因的功能提供一定的理论和分子基础。
1材料和方法
1. 1试验材料
采用匍匐翦股颖Penn-A4品种，拟南芥为Colum-
bia 生态型，两者皆由河北省作物生长调控实验室自行
保存，于人工气候室进行养护繁殖，培养条件为：23C ,
16 h 光照，光照强度为6 000 lx 。
实验所用 pEASY-Tl Simple Cloning Vector,
PCRmix，限制性内切酶均购于Takara 公司,GUS 试
剂采购于奥博莱公司，载体PCAMBIA1301、大肠杆菌
DH5a 感受态细胞和农杆菌感受态细胞GV3101均由
本实验室自行保存。
1.2 实验方法
1.2.1匍匐翦股颖HSP26. 7启动子的克隆 利用 CTAB 法分离纯化得到匍匐翦股颖的DNA，从NCBI
上查询得到HSP26. 7的起始密码子之前的2 403 bp 的序列作为启动子，根据所得到的序列信息设计了其
前后引物 HSP26. 7pro-Fl 和 HSP26. 7pro-Rl ，并以匍
匐翦股颖DNA 为模板对HSP26. 7基因启动子进行 体外扩增。扩增所得产物连接T 载体并测序，序列无
误后进行后续实验。
HSP26. 7pro-Fl ：5'- TA TGA AAG GCA TCA
NOS ： Term
RB LB
图1 植物表达载体pHLHSP26. J^-GUS/^S-bar 的构建
Construction of plant expression vector pHLHSP26. ^p^-GUS /35fy-bar
Figure 1
1.2.4拟南芥的转化与检测用花序浸染法口勺转化 拟南芥野生型。T0代种子收获后，播种于育苗盘，
用 草丁勝除草剂进行转基因阳性苗的筛选。筛选出的阳
性苗进行转基因PCR 检测。以拟南芥阳性苗基因组
AAT AGC TCT-3'
HSP26. 7pro-Rl ：5'- TG CTC AAG CGA GAA
TCA CAG -3'问道仙魔录
一双筷子1.2.2生物信息学分析 通过启动子序列分析软件
PlantCARE 数据库将已知的HSP26. 7的基因启动
子序列与一些已经被证实了功能的顺式作用元件进行
比对，寻找序列中可能参与环境胁迫、信号通路和生长 发育相关的顺式作用元件。
1.2.3
植物表达载体的构建为了检测HSP26. 7
基因启动子是否成功被克隆以及能否在植物体内正常 表达，本实验构建了 HSP26. 7基因启动子与GUS 报
告基因融合的表达载体P HL-pHSP26. 7-GUS/35S-
bar (图1)。具体过程为：以HSP26. 7pro-Fl 和 HSP26. 7pro-Rl 为前后引物，在前后引物的两端分别
添加BamH I 酶切位点，用1. 2. 1的方法进行体外扩
增。通过电泳检测所得的条带与预想大小是否一致,
并将所需的目标条带切割分离后连接pEASY-Tl
Simple Cloning Vector，挑选连接方向正确的质粒，用 BamB. I 进行单酶切，酶切产物经过分离后再连入
pSB 表达载体。体系如下：
2 X Rapid Ligation Buffer lO^L
pSB
1 卩L 回收片段 9
m L
T4 liga
1 卩L
连接后在人工培养箱内4C ，放置12 h 。用连接 液转化大肠杆菌DH5a 感受态细胞，并通过菌落PCR
检测转化是否成功，连接方向是否正确，再提取其质 粒。将序列正确的重组质粒用冻融法转入农杆菌
LBA4404 中。
NOS: Term
DNA 为模板，以引物HSP26. 7F 和HSP26. 7R 对 HSP26. 7进行体外扩增，以引物barF 和barR 对bar
基因(X17220. 1)进行体外扩增。
barF : 5 ^GTCTGCACCATCGTCAACCACTAC - 3
’
barR：5'-GTCC A GCTGCC A GA A ACCC A C-3' PCR扩增体系：
10X PCR buffer25m L dNTP mix(2.5mM each)05m L HSP26.7F/barF(10M M)10卩L HSP26.7R/barF(10M M)10卩L DNA模板10卩L Taq DNA polymera(^5U/mL)05m L ddH2O补至5pL
反应条件：
951
戒指怎么编红绳951
651购卩26.7)/609(bar)
72t
72t 3min
30s
30s
30s25cycles 5min
1.2.5转基因拟南芥植株的GUS组织化学染色将WT拟南芥和转化后的拟南芥移栽至苗床，基质为蛭石/营养土混合物(v/v=3=l)，在温室内培养，光照强度3000lx,16h光照，20C。保持良好的肥水供应使其生长势保持一致，待到开花时进行处理。热处理：植株置于40C培养箱中处理24h；盐处理：将植株根部浸泡在175mmol/L NaCl溶液8h；干旱处理：将植株从基质中挖出，洗净根部，用滤纸吸去植株上的水分，将植株放置在实验室的滤纸上2h。处理后将植株进行GUS组织化学染色。
GUS染液的配制(10mL)：
0.1mol/L磷酸缓冲液(pH7.2)5mL
10%Triton X0.2mL
0.1mol/L铁氤化钾0.2mL
0.1mol/L亚铁氤化钾0.2mL
0.1mol/L X-Gluc0.2mL
ddH2O补至10mL
将生长正常的拟南芥植株取样迅速浸泡在上述染液中，真空浸泡30min,37C避光温育12h。弃染液, 95%乙醇脱色，再将样品放入70%乙醇中待样品恢复原有形态后进行切片观察。染出蓝色的组织制作石蜡切片，置于显微镜下观察。2结果与分析
小书房装修效果图
2.1匍匐翦股颖HSP26.7启动子的克隆与序列分析
以HSP26.7pro-Fl和HSP26.7pro-Rl分别为前后引物，用提取的匍匐翦股颖DNA为模板进行体外扩增。电泳结果表明，在约2500bp处有一明显条带，其大小与预期结果相似(图2)。将此胶切下来由Takara公司测序，测序结果用PlantCARE软件进行顺式元件比对分析。结果显示HSP26.7基因启动子不仅具有响应高温胁迫的HSE元件和响应干旱胁迫的MBS元件等与植物抗逆性有关的顺式元件，还有RY-element,Skn-l motif等参与种子生殖生长的顺式元件(表1)。
M1
5147bp
2027bp
图2匍匐翦股颖HSP26.7基因启动子的克隆Fig.2Cloning of HSI26.7gene promoter from Ag^stis
stohnifera L.(M：Marker；1:HSI^6.7gene promoter)注：M：Marker；l：HSB26.7基因启动子
2.2转基因拟南芥的PCR检测结果
电泳检测结果显示，在2500bp处有一明显条带，表明HS际7启动子已经整合到拟南芥基因组中(图3)0
M WT12345678
图3转基因拟南芥PCR检测结果
Fig.3PCR detection results of transgenic
Arabidopsis thaliana
2.3转基因拟南芥GUS分析
转氨酶过高实验结果表明，
只有在高温诱导下的拟南芥植株
表1匍匐翦股颖HSP26.7基因启动子部分顺式元件预测
Table1Prediction of some cis・elements in promoter of HSI26.7gene in Agrostis stolonifera L.
元件序列元件数目功能
HSE CNNGAANNTTCNNGAAAAAATTTC2参与热应激反应
ABRE(C/T)ACGTG/CGTACGTGCA4参与脱落酸的反应
TCA-element GAGAAGAATA4参与水杨酸反应
AuxRR GGTCCAT1参与生长素反应
HD Zip1CAAT(A/T)ATTG2参与栅栏叶肉细胞的分化
HD Zip2CAAT(G/C)ATTG2参与叶片形态发育的调控
RY element CATGCATG1种子特异性调控所涉及的调控因素
Skin-1motif GTCAT2胚乳表达所需的调节元件
Spl CC(G/A)CCC2光响应要素
MBS CAACTG/CGGTCA4MYB结合位点参与干旱诱导
才能启动GUS基因的表达，在正常生长以及干旱和盐结果表明，染色区域主要集中在植株顶部的生殖器官胁迫的情况下并未检测到GUS的表达（图4）。染色当中（花或刚刚抽穗的角果中），还有少量染色区域集
A123“45
B
图4HSI26.7基因启动子转基因拟南芥的GUS组织染色
Fig.4Analysis of GUS activity in HSI26.7promoter transgenic Arabidopsis
注：A：转基因拟南芥的GUS染色。1：正常生长的植株；2：40C处理8h；3：40C处理24h；4：盐处理8h；5：干旱处理2h。
B：转基因拟南芥热处理24h花的GUS染色。6花序；7小花。C：转基因拟南芥热处理24h花器官GUS染色。8：花药和柱头；9：花药和花粉粒；10：柱头。
中在植株叶片的基部(图4A)。生殖器官中花药和花丝顶部以及雌蕊的柱头内的表达相对较多(图4B)。花药和柱头染色较重的区域集中在花药和柱头的顶部(图4C)。
3讨论
情感文字图片小热激蛋白是植物对抗逆境胁迫的一种重要的蛋白因子，属于分子伴侣的一种，帮助靶蛋白完成正确的折叠，形成正常的构象，从而使靶蛋白正常发挥功能，在植物面对高温胁迫时起到重要作用[1^2]。小热激蛋白相关功能的研究在草坪草中也有一定的进展]⑵，其中，匍匐翦股颖是一类性状极其优良的草种，但由于其耐热性差，导致夏季的养护管理成本较高，极大地影响了应用[10\小热激蛋白的过表达则为改善匍匐翦股颖在高温下的性状表现提供了一种可能。尽管已有资料指出小热激蛋白会受外界环境以及某些生理生化条件诱导，但是对于小热激蛋白感受逆境信号的机理以及改善植物抗逆性的机制尚不明确，本研究明确了小热激蛋白的表达部位以及表达的时空特异性，为HSP26.7基因的启动子的研究提供了理论基础。
启动子是位于结构基因上游、能够与RNA聚合酶特异识别并结合的一段DNA序列，虽不具有转录与翻译活性，却是在转录水平上基因表达调控的中心[17\本实验发现HSP26.7基因的启动子序列，设计特定的引物，将其克隆出来并转化了拟南芥。经过序列分析发现该序列除了具有基本的启动子特征外，还有包含很多特异的顺式作用元件[18]，响应高温诱导的顺式元件和与响应干旱诱导的顺式元件，由此推测sHSP26.7不仅仅受高温诱导表达，在干旱处理下也可能会表达[19\除此之外本研究还在启动子序列中找到了RY-element和Skin-1motif等生殖生长的相关顺式元件。由此推测sHSP26.7可能在植物不同的生长阶段的表达不同，可能在生殖生长阶段表达较高。
在几种常见的逆境(高温、干旱、盐处理)胁迫处理下进行GUS染色，结果表明仅在热胁迫条件下GUS 基因的表达并显色，即HSP26.7基因启动子才能激活，说明高温诱导能够激活或增加热激蛋白基因的表达，这与拟南芥HSP70-1、高粱HSP70、叶用萬苣LsHSP70^711等基因相同〔河。染色结果还进一步表明，染色区域主要集中在花器官的顶部。这与腊梅热激蛋白HSP1的启动子类似，该基因启动子在叶和根中几乎检测不到GUS活性，而在茎、花瓣、雄蕊和雌蕊中检测到GUS的表达加。此外在大豆GmbZlP33基因转基因拟南芥中GUS的表达也与本研究相似[16\本研究结果表明，植物的不同部位H SP26.7基因启动子的表达模式不同。本研究还发现GUS主要在花药内的花粉粒和柱头顶端的组织中表达。而HSP26.7基因启动子也含有与生殖发育相关的顺式元件(表1)，这些结果表明HSP26.7基因很可能与植物的生殖生长，种子发育密切相关。HSP26.7启动子序列中也含有响应干旱的元件，但是本研究中干旱处理后GUS表达量并没有显著变化，可能是由于试验处理方式、时间或者是不同物种而出现的结果，其具体原因还需要做进一步的研究和探讨。
4结论
本实验克隆了匍匐翦股颖中HSP26.7基因的启动子，并研究了其生物学功能。结果表明,HSP26.7启动子含有高温诱导相关的顺式作用元件(HSE,AT-rich element和TATA等)，也含有与生殖生长相关的顺式作用元件(RY-element和Skin-1motif等)。GUS染色结果说明,HSP26.7基因启动子只有在高温胁迫下才能被检测出来，并且主要表现在花粉粒、柱头组织及叶基中。说明HSP26.7只在高温胁迫下表达且具浪漫的歌
有组织特异性，主要在生殖器官中表达，可能与植物的生殖生长有关。
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