农杆菌浸种对甘蓝种子萌发及幼苗生长的影响
摘要：采用不同D600 nm值的农杆菌菌液浸泡甘蓝种子，研究农杆菌浸种对甘蓝种子萌发及幼苗生长发育的影响，并检测其转化效果。结果发现，农杆菌浸种对甘蓝种子的发芽率、发芽指数、活力指数均有抑制作用，且D600 nm值越高，抑制作用越明显。此外，农杆菌浸种对甘蓝幼苗的株高、叶面积、根茎比、鲜质量均有显著抑制作用。叶绿素含量随D600 nm值增大，呈先增加后降低的趋势，D600 nm为0.8时，叶绿素含量最高，为7.86 mg/g，D600 nm 为1.6时，叶绿素含量最低，为猫和老鼠45.64 mg/g。农杆菌浸种不影响SOD活性，但POD、CAT活性均随着D600 nm值的升高而升高。农杆菌浸种能获得一定的PPT抗性苗，其中D600 nm 为0.8时获得的抗性苗最多，达到10.32%。PCR结果显示农杆菌浸种能实现基因的转化，其中D600 nm 为1.6时转化率最高，达到2.33%。
关键词：甘蓝；农杆菌浸种；种子萌发；幼苗；转化
中图分类号： S635.04 文献标志码： A
文章编号：1002-1302（2015）03-0139-03
农杆菌介导的遗传转化是目前较广泛应用的转基因方法，但是常规的农杆菌介导法依赖于组织培养[1-2]，导致其应用受到一定的限制。农杆菌浸种法是近年诞生的一种转基因方法，是将萌发的种子直接浸在农杆菌菌液中，利用农杆菌的浸染特性和植物细胞自身的物质转运系统把外源基因导入受体细胞并整合到基因组中稳定表达，从而实现遗传转化[3]，如Feldmann等首次利用农杆菌浸种法将npt[QX（Y15]Ⅱ[QX）]基因导入了拟南芥[4]，该方法后来相继在水稻、小麦、黄瓜、番茄、中华结缕草等植物遗传转化中取得了成功[5-8]。甘蓝的遗传转化研究起步早，目前已相继导入抗虫基因Bt、蛋白酶抑制剂基因、育性基因、抗病基因、生长素基因等[9]。纵观甘蓝的遗传转化，最常采用的方法还是依赖于组织培养的农杆菌介导的遗传转化，笔者所在实验室采用该传统的转化方法获得了部分激活标签突变体[10]，但是转化效率低下，且需要在无菌条件下进行离体操作。因此，本研究将采用农杆菌浸种法，将含激活标签pSKI015的农杆菌转化甘蓝，调查浸种对甘蓝种子萌发及幼苗生长的影响，并探讨其转化效果，以期获得一种甘蓝激活标签突变体材料的简便转基因方法。
1 材料与方法
1.1 供试材料
供试甘蓝为夏光种子，供试农杆菌为GV3101（含质粒pSKI015）。
1.2 农杆菌的培养
用LB培养基接种农杆菌，28 ℃、220 r/min振荡培养过夜，分光光度计测定600 nm下的D值。
1.3 农杆菌浸种
取成熟饱满发芽率85%以上的种子，用0.4% KMnO4浸种6 min，无菌水冲洗3～4次，25 ℃催芽。待种子80%露白时，再用无菌水冲洗干净，加入农杆菌液，农杆菌菌液D600 nm分别为0（未加入农杆菌的LB溶液，对照）、0.4、0.8、1.2、1.6。浸种2 h，倒掉菌液，25 ℃黑暗条件下培养2 d后转入铺有滤纸的培养皿（滤纸使用1 mg/L如何注销微信的PPT浸湿，适时补加），置于 20 ℃、14 h/d光照的培养箱中培养，观察记载发芽情况。
1.4 幼苗移栽
种子发芽后统计发芽率、发芽势、活力指数。用自来水将幼苗冲洗干净，移栽于穴盘培养。
1.6 生理指标测定
取移栽30 d的苗，测定各生理指标[11]。采用丙酮提取法测定叶绿素含量，氮蓝四唑光化还原法测定超氧化物歧化酶（SOD）活性，紫外吸收法测定过氧化氢酶（CAT）活性，愈创木酚法测定过氧化物酶（POD）活性。
1.7 PPT抗性苗筛选
世界航母数量排名 浸种后的种子播种在含1 mg/L PPT的培养皿中发芽，移栽穴盘后后喷施10 mg/L Basta溶液。
1.8 PCR检测
CTAB提取PPT抗性苗叶片基因组DNA，以BarF （5′-TCGACTCTAGCGAATTC）和BarR（5′-ATAGGCGTCTCGCATATCTC）为引物扩增长度为700 bp的bar基因，未转化的甘蓝为阴性对照，pSKI015为阳性对照，扩增方法和程序参照王爱荣等的方法[12]。PCR 反应总体积 25μL。扩增程序：5 ℃ 预变性5 min；95 ℃变性 30 s，60 ℃退火 30 s，72 ℃延伸 35 s，柯尔克孜30 个循环；72 ℃延伸 5 min银耳莲子百合汤。取扩增产物10 μL于1% 琼脂糖凝胶上电泳。
1.9 数据处理
用SPSS系统软件进行数据处理，Microsoft Excel软件作图，鬣狗的天敌P<0.05作为显著性检测标准。
2 结果与分析
2.1 农杆菌浸种对甘蓝种子萌发的影响
由表形容眼睛的词语1可知，随着农杆菌D600 nm的升高，甘蓝种子发芽率基本呈现下降趋势，其中D600 nm 为0.4时，与对照差异不显著，但是D600 nm为0.8、1.2、1.6时的发芽率显著低于对照，D600 nm为1.6时，发芽率最低，D600 nm为0.8 和D600 nm为1.2处理之间差异不显著。发芽指数的变化与发芽率的变化类似，随着一公里多少油钱怎么算D600 nm的升高而降低，除D600 nm为 0.4与对照差异不显著外，其他各处理的种子发芽指数均显著低于对照。种子活力指数的变化也是随着D600 nm的升高而降低。除D600 nm为 0.4与对照差异不显著外，其他各处理的种子活力指数均显著低于对照。不同的D600 nm之间也存在差异，其中D600 nm 为1.6处理下，种子的活力指数最低，仅为53.6%。由此可知，农杆菌的D600 nm过高，对甘蓝种子的萌发有抑制作用。
2.2 农杆菌浸种对甘蓝幼苗生长的影响 由表2可知，对照组的根茎比最大，且随着D600 nm值的增加，根茎比逐渐减小，所有处理的根茎比均显著低于对照，D600 nm为 0.4、0.8、1.2 3者之间差异不大，D600 nm为1.6处理时的根茎比最低，仅为0.70，比对照降低了约18%。因此，农杆菌浸种对甘蓝幼苗的根茎比有抑制作用。甘蓝幼苗的叶面积也随着D600 nm值的增加而降低，其中D600 nm为 0.4与对照差异并不显著，对照组的叶面积最大，D600 nm为 1.6的叶面积最小。由此可知，农杆菌浸种对甘蓝幼苗叶面积有抑制作用，在D600 nm高于0.8时开始表现较明显的抑制效应。株高的变化与根茎比和叶面积的变化有所不同，仅在D600 nm为1.2、1.6下表现抑制效应。在D600 nm达到1.6时，株高仅为对照的72%。所有单株鲜质量中，对照组最大，与各处理之间差异显著。D600 nm值为1.6时单株鲜质量最低，仅为对照的56%，D600 nm 为0.4、0.8、1.2 3组之间差异不显著。由此可见，农杆菌浸种对甘蓝幼苗生长存在一定的抑制作用。
