硕士学位论文
南极海冰细菌Pudoalteromonas sp.的Trx 与TrxR基因克隆、表达及特性分析
CLONING, EXPRESSION, AND CHARACTE- RISTIC ANALYSIS OF THIOREDOXIN AND THIOREDOXIN REDUCTASE GENES FROM ANTARCTIC SEA-ICE BACTERIA
Pudoalteromonas sp.
曲俊杰
哈尔滨工业大学
2013年6月
国内图书分类号：Q939 学校代码：10213 国际图书分类号：579 密级：公开
理学硕士学位论文
南极海冰细菌Pudoalteromonas sp.的Trx 与TrxR基因克隆、表达及特性分析
硕士研究生：曲俊杰
导师：王全富副教授
陂的组词申请学位：理学硕士
学科：微生物学
所在单位：海洋科学与技术学院
答辩日期：2013年6月
名师伴你行
授予学位单位：哈尔滨工业大学
Classified Index: Q939
U.D.C: 579
Disrtation for the Master Degree in Science
CLONING, EXPRESSION, AND CHARACTE- RISTIC ANALYSIS OF THIOREDOXIN AND THIOREDOXIN REDUCTASE GENES FROM ANTARCTIC SEA-ICE BACTERIA
Pudoalteromonas sp.蔡国权
Candidate：Qu Junjie害怕的英语
Supervisor： A.P. Wang Quanfu Academic Degree Applied for：Master of Science Speciality：Microbiology
Affiliation：School of Marine science and Technology
Date of Defence：June, 2013
Degree-Conferring-Institution：Harbin Institute of Technology
哈尔滨工业大学理学硕士学位论文工作证明怎么写
摘要
硫氧还蛋白系统是生物体内重要的抗氧化系统之一，主要包含有硫氧还蛋白（Trx）、硫氧还蛋白还原酶（TrxR）和NADPH，该系统通过调节酶活性、转录因子、各种胁迫应答和信号传导等，在生物抗逆系统中起着重要的作用。南极由于其独有的地理及气候特征，形成了一个干燥、酷寒、强辐射的自接吻的教程
然环境，蕴育了丰富的微生物资源。在长期的进化和生长过程中，微生物形成了极为独特的基因资源、遗传背景及新的代谢特征。本论文以南极海冰细菌Pudoalteromonas sp.为材料，对硫氧还蛋白系统中两个重要成员Trx与TrxR 的基因进行了克隆、异源表达以及活性研究，以期进一步完善南极微生物低温适应性的分子机制，获得具有自主知识产权的功能基因，为抗逆生物遗传育种提供新的基因。
（1）在前期从海冰细菌Pudoalteromonas sp.ANT178中克隆出Trx全长基因（Ps Trx）的基础上，本论文利用生物信息学方法对Ps Trx进行了分析和预测。该基因大小为327 bp，编码108个氨基酸，理论分子量为11.9 kDa，等电点pI=4.50，推测其关键活性位点为Cys33和Cys36，结构模型中含4个α-螺旋和5个β-折叠。将Ps Trx基因转入E.coli BL21中，实现了异源表达，并对该重组蛋白进行了Ni-亲和层析纯化及活性测定。结果表明，经纯化后的Trx 重组蛋白比活力为96.67 U/mg，纯化倍数达22.22倍，总回收率为27.26%；其最适反应温度为25℃，最适反应pH为7.0。Ps Trx在高盐（2 M NaCl）环境中仍保留一定的活性。变性剂SDS对蛋白活性的抑制力最强，相对活性仅为22.94%，氧化剂H2O2对Ps Trx的抑制作用最小，相对活性可高达95.36%。
（2）Ps Trx基因转入E.coli BL21后，重组菌株耐盐性显著提高，在盐度为9%培养条件下，其最大OD600吸光值可以达到1.316，而野生型大肠杆菌的OD600仅为0.393。利用FQ-PCR相对定量2-△△Ct法测定不同盐度下海冰细菌Ps Trx表达情况，高盐度下（5%-9% NaCl）的Ps Trx表达量高于对照组（
3.3% NaCl），其中9%盐度下的表达量是对照组的2.5倍，这表明Ps Trx基因在菌体的耐盐机制中起着重要作用，进而可为耐盐遗传育种提供新的基因。
引用论文格式（3）从菌株Pudoalteromonas sp.ANT178克隆出TrxR基因，命名为Ps TrxR，该基因具有完整的基因阅读框，大小为951bp。生物信息学分析表明该基因编码316个氨基酸，Ps TrxR的理论分子量为33.7 kDa，等电点为4.98，推断的活性位点为Cys136和Cys139，蛋白结构内含5个α-螺旋和18个β-折叠。将Ps TrxR转入E.coli BL21中成功表达，利用Ni-亲和层析对重组蛋白进
哈尔滨工业大学理学硕士学位论文牛肉锅仔的做法
行纯化，重组蛋白比活力为29.71 U/mg，总纯化倍数达26.29倍，总回收率为35.75%。重组Ps TrxR的最适反应温度为20℃，最适反应pH为7.0，该酶在50℃处理40 min后，酶活性下降至66%。以DTNB为底物测定酶动力学参数
K m和V max分别为1.15 mM和5.17 nmol/mL/min。变性剂DTT对Ps TrxR酶活
的抑制作用为100%，金属离子Zn2+对酶的抑制作用小，相对剩余活性可达71.38%。
关键词：南极海冰细菌；硫氧还蛋白；硫氧还蛋白还原酶；实时荧光定量PCR；
耐盐性
