人表皮生长因子的纯化及浓度在线检测
童望宇1, * ， 姚善泾2, *
袋鼠怎么画， 朱自强2
（1上海市华东理工大学生物反应器工程国家重点实验室 上海市 200237；
2浙江省杭州市浙江大学化学工程与生物工程系，杭州 310027）
摘要 在分离纯化快速开拓系统（ÄKTA explorer 100）中用凝胶（Sephadex G-50 superfine ）纯化人表皮生长因子，并在优化条件下对其纯化过程中的hEGF 进行定量测定。用标准人表皮生长因子经离子交换柱、蛋白质扫描分析系统及SDS-PAGE 间相互印证，结果表明：在优化条件下，可得到在SDS-PAGE 上与标准样品hEGF 一样清晰的单条带，其产品纯度高于94%，回收率高于36%；其检测的灵敏度可达1μg/ml 。该法不仅对人表皮生长因子的在线检测行之有效，而且对其它蛋白质纯化的在线检测也具有参考价值。
关键词 人表皮生长因子，层析，检测，纯化
中图分类号 TQ0333 Q819
引言
人表皮生长因子（human epidermal growth factor ，hEGF ）是由53个氨基酸残基所组成
的多肽生长因子，分子量约为6200D [1]。人表皮生长因子具有在体内刺激皮肤组织、角膜、肺、气管上皮组织的生长繁殖及抑制胃酸分泌等多种生物学作用，因而可应用于外科伤口的愈合及溃疡病的治疗等医疗领域[2-5]。自1975年Cohen 等人[1]从尿液中首先分离纯化得到人表皮生长因子以来，有关研究的进展很快，除了继续研究从天然来源中分离纯化以外，基于基因工程菌发酵生产也已问世[6-7]，但是不管是从天然资源，还是来自基因工程菌发酵液，hEGF 的浓度总是偏低，需要经过较长时间的分离和纯化流程，才能得到相对较纯的产品。为了设计一个高效和可控的纯化过程，hEGF 的在线分析和检测就成为非常重要。
目前，hEGF 的定量检测方法主要有放射免疫分析（Radio immuno-assay, RIA ）[4]、放
射受体分析(Radio receptor assay, RRA) [8]、酶联免疫吸附分析（Enzyme-linked immunosorbent assay, ELISA ）[9]、酶免疫分析（Enzyme immunoassay, EIA ）[10]、反相HPLC [11]和免疫荧光技术[12]等。以上各种方法均有其特点和不同的条件局限性，但均难用于过程的在线检测。
我们在使用ÄKTA explorer 100进行蛋白质纯化时发现，该系统通过本身带有的软件，
不仅可以与各种层析柱结合进行多种生物质的分离流程研究，而且还可以比较精确地通过出峰面积表示蛋白质量的多少。利用这种定量关系，就为定量确定生物质含量提供了基础。以此为依据，对hEGF 这个比较难于定量与分离的多肽，进行了凝胶层析中在线检测与纯化工艺的优化，达到了纯化与在线定量检测的目的。
1 材料与方法
1.1 仪器与试剂
联系人：童望宇，姚善泾， E-mail: tongwy@ecust.edu , yaosj@che.zju.edu
第一作者：童望宇，男，40岁，博士
* 国家自然科学基金资助项目(批准号：29736180)
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分离纯化快速开拓系统（ÄKTA explorer 100）、进样柱（Superloop TM 50）、层析柱（XK 16/20）、离子交换预装柱（RESOURCE Q6）、凝胶（Sephadex G-50 superfine）、蛋白质扫描分析系统（Image Master VDS Video Documentation System）购自Amersham Pharmacia Biotech AB.
Sweden；电泳仪（Mini VE complete）购自Amersham Pharmacia Biotech Inc., USA；hEGF 标准品购自Pepro Tech EC Ltd, England。其它试剂均为市售的分析纯试剂。
平衡液：pH 7.0，0.02M的磷酸缓冲液（PBS）；
洗脱液：pH7.0 PBS+2 M NaCl的磷酸盐缓冲液。
1.2 样品的预处理
将含有hEGF的发酵液[13]经冷冻离心机进行离心（8000rpm，10min, 4 0C），收集上清液，取该上清液1000 ml，用1M浓度的盐酸小心调发酵液的pH于4.6左右，缓慢加入210 g硫酸铵（硫酸铵饱和度为：35%），搅拌溶解，4 0C下静置4～24小时，至沉淀彻底，人表皮生长因子进入沉淀中。虹吸去除700～850 ml上清液，剩余的150～300 ml于4 0C条件下8000 rpm、20 min离心，收集沉淀。用100 ml 平衡液搅拌溶解沉淀，形成悬浊液，4 0C下静置4～24小时，待溶解充分后，于4 0C下8000 rpm、20 min离心，收集上清液，于4 0C 下保存备用。
1.3 hEGF的定性分析
hEGF的定性分析用SDS-PAGE电泳[14]。
1.4 hEGF的定量分析
1.4.1 实验原理
在蛋白质及多肽分子中，酪氨酸、色氨酸及苯丙氨酸等芳香氨基酸的苯环含有共轭双键，因而具有吸收紫外线的性质，吸收高峰在280nm波长处。在此波长范围内，蛋白质溶液的光吸收值（A280）与其含量呈正比例关系（m =f ×A，式中m为蛋白质的含量，f 为比例系数，A为峰面积），由此可用作总蛋白质及被纯化蛋白质的定量测定。
1.4.2 实验设计
对待测浓度的目标蛋白，可先用标准样品在相同层析条件下确定其保留值，再用其它方法给予验证，为定量分析提供基础。不同样品的组成各不相同，实验中应尽可能优化层析条件，扩大目标产物与其它组成的保留值差距以提高检测的准确性。由于ÄKTA explorer 100能够提供相应正确的峰面积与蛋白质定量关系，因此在hEGF的纯化中，将其与凝胶柱结合，并在优化条件下，进行hEGF的纯化与在线检测，然后再配以SDS-PAGE及蛋白质扫描分析系统的进一步印证。使得分析的可信度大为提高。
2 结果与讨论
2.1 hEGF标准曲线的制定
为考察ÄKTA explorer 100紫外检测仪的灵敏度及紫外吸收峰面积与蛋白质浓度的关系。实验选用了R
ESOURCE Q6强阴离子预装柱，用Unicorn3.0所推荐的模板[15]经空柱(bypass)流程对多种标准蛋白质进行了多浓度水平反复验证，并用牛血清白蛋白标准品共进行了5次μg/ml级重复测定，其标准偏差为0.9948。在此基础上，采用了浓度为2μg/ml hEGF 的标准hEGF，分别用1.0、2.0、4.0、6.0、8.0和10.0ml的体积进样，测试其峰面积与进样量的关系，结果如图1、2所示。
A r e a (m A U ×m l )Standard hEGF (μg)
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图 1 标准hEGF 层析图 图 2 hEGF 标准曲线
Figure 1 Chromatographic profile of standatrd hEGF Figure 2 Plot of peak area vs standard hEGF
由图1可见：随着进样量的增加，出峰明显变宽，峰面积增加，其峰面积的具体数据由
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ÄKTA explorer 100自动给出，由此作成了由图2所示的峰面积与样品含量关系图，作为标准曲线。其关系可由下述方程给出：
4127.00971.2−=C A （1）
式中A 表示峰面积（mAU*ml ），C 表示hEGF 含量（μg ）。该方程的方差R 2为0.9995，表
明标准hEGF 样品的峰面积与样品含量呈良好的线性关系。
2.2 人表皮生长因子标准曲线的延伸鼻子山根
为进一步检测样品中较高浓度的hEGF 与峰面积的关系，扩大上述方程的使用范围，我
们加大了被测样品的量，这里采用了我们自己纯化的hEGF （简称纯化hEGF ）样品，使图2的标准曲线得以延伸，结果如图3所示。
A r e a (m A U ×m l )Purified hEGF (μg)
条子肉的家常做法图 3 纯化的hEGF 曲线
Figure 3 Plot of peak area vs purified hEGF
图3结果表明，在hEGF 的浓度放大了10倍以后，hEGF 含量与峰面积的曲线不仅保持
了良好的线性关系，而且还很好地与图2相连接。这种良好的线性就可为在较广的浓度范围内实现在线检测hEGF 提供依据。相应的回归方程是：
6989.10916.2−=C A
（2）
用上述方程回归，其方差R 2为0.9997，说明hEGF 样品的峰面积与样品含量呈良好的
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线性关系。但值得注意的是，方程（2）中的系数与方程（1）的系数稍有差别，主要体现在方程的截距上，也就是说，用方程（2）计算低浓度时，误差会稍大些。但是用方程（1）外推到浓度较高时，精确度就相对较高。
2.3 人表皮生长因子的纯化及浓度在线检测
在实验中，我们发现发酵液中目标产物hEGF的分子量(~6200D)与其它蛋白质的最小分子量（~18000D）相距约10000D以上，故用凝胶Sephadex G-50 superfine进行hEGF的纯化。优化后的纯化条件为：柱床高度=16 cm，线性流速=6 cm/h，进样量=1 ml。此条件下的层析结果如图4所示。
图 4 样品纯化过程中的Sephadex G-50凝胶层析图
Figure 4 Gel chromatographic profile of the supernatant being purified
从图4可见，在两个大峰群中间所夹的一个小峰，其保留体积与我们在相同条件下所测到的标准hEGF样品的保留体积相一致，再用SDS－PAGE分析后，确认该小峰就是hEGF 峰。与其它杂质峰基本分离。经ÄKTA explorer 100检测，1 ml样品中总峰面积为11996 mAU*ml，hEGF峰面积为327 mAU*ml，计算得hEGF峰面积比值为2.73%，此即该盐析液中hEGF的含量（%）。由标准曲线回归方程（1）可得，hEGF的绝对含量为156.13 μg，于是其浓度就为156.13 μg/ml；如果用方程（2）计算，绝对含量为157.15 μg，浓度为157.15 μg/ml。由此可见，两方程的计算结果基本一致。故标准曲线可从20μg延伸至200μg不会造成很大误差。
2.4 纯化结果验证
上述纯化后的收集液经冷冻干燥后，得到了白色的hEGF粉末。随后我们对该产品用阴离子交换预装柱（RESOURCE Q6）在其推荐操作条件下进行了分析，得到了如图5-A所示的结果，同时也对标准品进行了检测，以作对比之用，结果如图5-B所示。
A （A purified hEGF）
B（Standard hEGF）
图 5 纯化hEGF与标准hEGF的RESOURCE Q6阴离子交换层析图
Figure 5 Anion exchange chromatographic profile of hEGF
ÄKTA explorer 100自动分析记录图5-A的hEGF保留体积与纯度（峰面积%）分别为25.17 ml和94.87%，图5-B中hEGF的保留体积与纯度（峰面积%）分别为24.99ml和94.88%，两者的纯度相当，说明采用了在线检测方法后，纯化产品的效果良好。事实上，由于过程中能随时给出产品的浓度与纯化条件的关系，使hEGF纯化过程的优化方便不少。
为进一步验证实验结果，用上面纯化得到的hEGF产品与标准hEGF样品经SDS-PAGE 检测，并将其
图谱用蛋白质扫描分析系统（Image Master VDS Video Documentation System）进行分析。结果表明，两种hEGF样品在SDS-PAGE中，都呈现出一条色带（图6）；且用蛋白质扫描分析系统测得其纯化产品的纯度为94.68%，与用阴离子交换预装柱测得的纯度(94.87%)基本一致。
图6 纯化hEGF和标准hEGF的SDS-PAGE图谱
Figure 6 SDS-PAGE of purified and standard hEGF
Lanes 1 and 2 hEGF purified under the optimal conditions
Lane S Standard hEGF
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3 结语
ÄKTA explorer 100结合层析柱可以同时实现hEGF纯化与在线定量检测的目标，其检测的准确度随目标产物浓度的提高而提高。这种在线检测的纯化方法，具有过程集成化的优势，如果再进行适当的放大，有希望将其用在hEGF较大规模的生产。这种具有检测方便、操作简单、条件温和、纯化周期短、纯度高及回收率大等优点的流程，对纯化其它高附加值的生物质同样具有参考价值。
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