乳液PCR扩增复杂基因序列的方法建立及普通PCR的比较
章爱娣;徐敏轩;韦婷;周东蕊
【摘 要】该研究分析普通PCR的不足，通过较多实验研究初步建立乳液PCR方法，改善PCR实验技术．采用人工合成的乳酸杆菌质粒为模板，不同成分配比条件下的乳液PCR和普通PCR对质粒序列进行扩增，对扩增产物进行琼脂糖凝胶电泳，电泳结束后对凝胶进行Gelred染色并用GS-800灰度扫描仪成像．进一步分析乳液PCR和普通PCR扩增产物的特异性以及不同成分配比条件下乳液PCR的扩增质量．通过比较两种PCR方法的扩增结果可得，在相同条件下，乳液PCR扩增特异性高于普通PCR扩增，并确定当水相中加入100g／LBSA，水油体积比在1：2．5时，破乳水饱和乙醚体积比为1：1时，水油相在1700rpm条件下连续混合5min时扩增效果最好．%In the prent study, the shortage of Amplification Complex Gene Sequence by Conventional PCR was analyzed, and then a protocol was constructed to minimize the problems. With the plasmid of Lactobacillus as a template, different components of the emulsion PCR and the conventional PCR plasmid template were effectively amplified to promote the amplified product with PCR to carry on agaro el
ectrophoresis. With that accomplished, the Gelred dyeing was done to the gelatin and the image formation was obtained by a GS-800 gradation scanner. Then a further analysis was made to get the specialities of the emulsion PCR and the conventional PCR amplified products and the producing quality by emulsion PCR. In terms of different components, it was found out by contrasting the two methods that the speciality of the emulsion PCR amplification was higher than that of the conventional PCR with the same conditions. Moreover, when 100 g/1 BSA was added to aqueous pha with the volume ratio of water-in-oil(w/o) at 1:2.5, the volume ratio of breaking water-saturated diethyl ether at 1:1 and water and oil mixture was thoroughly mixed in 5 min at 1700 rpm, the best amplification effect was obtained.isif
【期刊名称】《南京晓庄学院学报》
【年(卷),期】2012(000)006
公务员职称等级【总页数】4页(P69-72)
【关键词】乳液PCR;普通PCR;BSA;破乳
【作 者】章爱娣;徐敏轩;韦婷;周东蕊
【作者单位】东南大学学习与研究中心,江苏南京210093;东南大学学习与研究中心,江苏南京210093;东南大学学习与研究中心,江苏南京210093;东南大学学习与研究中心,江苏南京210093
【正文语种】中 文营养生殖
【中图分类】S852.61
Korana于1971年最早提出“经过DNA变性，与合适的引物杂交，用DNA聚合酶延伸引物，并不断重复该过程便可克隆tRNA基因”的体外扩增设想仅过了40年左右的时间，但是人们致力于研究基因体外分离技术的进程已有100多年的历史[1]，PCR技术是分子生物学领域的一项里程碑，问世以来就得到重视[2].PCR技术作为一种DNA体外扩增技术，具有特异性强，灵敏度高，快速简便，重复性好，所需模板量少以及实验前不需要模板DNA的序列信息等优点[2，3]，已广泛应用于法医检测，临床诊断，分子生物学研究等领域[4].至今，PCR技术已向诸多研究领域渗透及多元化发展，形成诸如Q-PCR，Real-time PCR，免疫PCR等多种PCR方法[4，5]，大大加快了分子生物学的发展.
但普通PCR也存在一定的缺陷，如DNA模板容易被污染、16S rRNA基因操纵子非均质性引起的序列变异[6]、嵌合体和异源双链的形成、不同模板之间扩增效率的固有差异、扩增即将结束阶段丰度较高的模板发生自退火而抑制扩增[7]等.因此会产生引物二聚体，异源双链等非特异性的片段，使得扩增结果有较大的偏差.PCR扩增主要有两种情况:一是短链DNA片段经过PCR扩增为长的片段，二是人工制备同源重组的 DNA文库[6，7].当只有一种引物和多种模板时，普通PCR扩增会产生非特异性的嵌合体，并且占据主导地位优先扩增(图1)[7]，从而产生偏差.在实验中可增加模板加入量或减少PCR 的循环次数来解决这一问题[8，9].然而，实践证明实验效果仍不能令人满意[9，11].
本文采用乳液PCR方法来解决上述问题.通过形成油包水的微球反应体系[19，20]，使各个微体系既相互独立又相互联系，在多种模板和多对引物存在时仍能准确扩增出特异性的序列片段，解决了普通PCR易产生嵌合体和异源二聚体的问题，大大提高了扩增效率[10，11].
1 实验材料
图1 乳液PCR方法与普通PCR方法的基本原理比较
低温高速离心机Eppendorf5804R(Eppendorf公司);2.5 μl、10 μl、100 μl、1000 μl微量移液器(Eppendorf公司);凝胶成像系统Syngene(Gene Genius公司);Nanophotometer仪(德国Implen公司产品);GS-800灰度扫描仪(Bio-Rad公司).
2 实验方法
2.1 油相制备
取50ml离心管，在25℃条件下按表1所列成分配制油相.
表1 乳液PCR油相成分成分 含量 终百分比Span 80 2.25 ml 4.5%(vol/vol)Tween 80 200 μl 0.4%(vol/vol)Triton X －100 25 μl 0.05%(vol/vol)Mineral oil to 50 ml
移取750 μl已配制好的油相均分成两份(375 μl/份)，分别置于两个低温冷冻管中，每管中各加入一根3×8 mm磁棒，置于磁力搅拌器上在25℃，1700 rpm条件下连续搅拌使其充分混匀.
2.2 水相制备
取1.5 ml微型离心管，在25℃条件下按表2所列成分配制水相.
表2 乳液PCR与普通PCR水相成分注:括号中为BSA不加时的成分配比.乳液PCR 普通PCR成分 含量/μl 成分 含量/μl 空白含量/μl PCR buffer(Mg2+free) 30 PCR buffer(Mg2+free) 15 5 Forward primer 6 Forward primer 3 1 Rever primer 6 Rever primer 3 1 dNTPs 6 dNTPs 3 1 DNA polymera 3 DNA polymera 1.5 0.5 Mg2+ 30 Mg2+ 15 5 Template DNA 6 Template DNA 3 0 BSA(100 g/L) 15(0)ddH2O 198(213) ddH2O 106.5 36.5 Total 300 Total 150 50
2.3 乳液制备
1)将300 μl乳液PCR 水相按每份150 μl分为两份，一份加入BSA，另一份不加BSA.
2)将两份乳液PCR水相在25℃条件下按水油体积比1∶2.5的比例分别逐滴滴入不停搅拌的油相中，并且水相必须在2 min中内全部滴加完毕，当全部滴加完后，继续搅拌5 min使其形成乳液，最终，在乳液中应有108—109个微球反应体系.
3)取 PCR管10只，将配置好的乳液、普通PCR水相、空白按照每管50 μl分装到PCR管中
并在乳液PCR管中每管覆盖10 μl石蜡油.
2.4 PCR 扩增
反应条件(30轮)按表3所列温度条件与循环次数进行扩增假期旅游
表3 乳液PCR扩增温度-循环反应条件循环次数 变性温度 退火温度 延伸温度1 95℃2 min 2—31 95℃ 30 s 55℃ 30 s 72℃ 30 s 32 72℃30 s
2.5 乳液PCR破乳
跟踪路由命令量取无水乙醚与双蒸水各10 ml置于50 ml离心管中，在旋涡振荡器上震荡5 min使其充分混匀后静置30 min，取上层乙醚相即为水饱和乙醚.
干竹笋将扩增完成的乳液PCR管置于高速离心机中，在13000 rpm，25℃条件下离心5 min，去除上层覆盖的石蜡油.向乳液PCR管每管各加入等体积的水饱和乙醚涡旋震荡，将震荡后的乳液在13000 rpm，25℃条件下离心5 min以去除上层剩余油相并破乳，此步骤重复2—3次.将破乳后的乳液PCR管样品置于25℃真空干燥箱干燥5 min，使剩余乙醚完全挥发.
2.6 扩增产物的检测
将扩增产物移取10 μl上样于2%琼脂糖凝胶，Gel Red染色，于1×TAE缓冲液中150 V电泳20 min，以50bp DNA ladder为Marker，使用凝胶成像系统Syngene检验.
性价比高的显卡3 实验结果
3.1 乳液PCR与普通PCR扩增产物(见图2)
3.2 有无BSA的乳液PCR扩增产物(见图3)
4 分析讨论
4.1 乳液PCR与普通PCR扩增产物分析
本研究以人工合成的乳酸杆菌质粒为模板进行扩增，所得扩增片段长度在230bp左右，与预期长度相符.图2显示普通PCR的三个平行样本都带有不同程度的拖尾和杂带出现，分析可能为引物二聚体，异源双链或者其他非特异性的碱基序列.从图2中还可以看出，在相同条件下，反应体系存在于微球体系中的乳液PCR扩增特异性强，减少了拖尾和非特异性片
段扩增产物的出现.
4.2 不同水油比对乳液质量的影响
乳液质量的优劣是乳液PCR能否达到预期效果的关键步骤.高质量的乳液呈奶油白色，混合均匀，经3 h—5 h放置不会出现分层现象即为优质乳液，若乳液呈现灰白色或着清亮半透明色，且有或经PCR后分层则为低质量乳液.另外，在配置乳液时搅拌子转速控制在1500 rpm—1800 rpm为最佳.若转速过高则油相不易包被水相且易被打散最终可能导致分层，若转速过低则会包被混合不均匀，最终也可能导致分层.
4.3 BSA对乳液PCR扩增产物的影响
BSA作为Taq DNA polymera的稳定剂，在乳液PCR过程中确保聚合酶作用的正常进行[12，16-18].图3显示当没有BSA加入时，只有少量或没有扩增产物出现.经分析，油相中可能存在一些未知的大分子蛋白，这些蛋白在DNA聚合酶作用时会抑制或终止其催化作用，导致只有少量或没有扩增产物出现;当加入BSA时则有清晰的条带出现.因此BSA对于乳液PCR扩增产物的有无具有较大的影响.
4.4 乙醚对破乳过程的影响
本研究选用水饱和乙醚破除乳液相，乙醚是有节制的溶于水(6.9 g/100 ml)[13-15].若破乳时采用无水乙醚则会吸取样品水相中的水，导致水相减少甚至无水相.
通过比较乳液PCR与普通PCR这两种方法，初步建立了乳液PCR扩增复杂基因序列的实验方法，得出乳液PCR油相的制备方法、水相的配比、破乳的过程以及不同水油比例对扩增结果的影响.研究发现当水油体积比在1∶2.5时，破乳水饱和乙醚体积比为1∶1时，水油相混合在5 min、1700 rpm条件下得到了最佳的扩增结果.同时，是否加入BSA对乳液PCR扩增产物的有无有重要影响，这说明BSA作为Taq DNA polymera的稳定剂对其催化作用的是否正常进行起到关键作用.另外，进一步分析结果得出，在相同条件下，乳液PCR与普通PCR扩增产物荧光亮度相当，但普通PCR含有较多杂带和拖尾现象，乳液PCR没有这些现象出现，说明乳液PCR扩增特异性高于普通PCR.
