第21卷第4期
2021年4月
过程工程学报
T h e Chine Journal of Process Engineering
Vol.21 No.4 Apr. 2021
D O I : 10.12034/j .issn. 1009-606X.220141
Preparation of submicron Pickering emulsion stabilized by cellulo nanocrystals
12指肠
Yanling QU 1-2, Jie WU 2*, Guanghui M A 2
1. School of C h e mical Engineering, University of Chine A c a d e m y of Sciences, Beijing 100049,
China
2. National K e y Laboratory of Biochemical Engineering, Institute of Process Engineering, Chine A c a d e m y of Sciences, Beijing
100190, China
Abstract : Compared with the traditional surfactant -
stabilized emulsions , Pickering emulsions stabilized
by solid particles have the advantages of strong interfacial stability , versatility , and low toxicity . A number of cas have demonstrated the potential of Pickering emulsions in biomedical applications . Submicron Pickering emulsion has a larger specific Oil pha
W a t e r plia
squalene
C N C s
Pickering ennilsions
surface area and more efficient delivery efficiency
than large-sized Pickering emulsions , which is expected to further expand the advantages of Pickering emulsions in the biomedicine fields . However , the size o f Pickering emulsions is
Pickering emulsions
增值额
C L S M of Pickering emulsions
determined by many factors such as particle properties , characteristics of oil and water pha . And it is difficult to arrange the rigid particles in a limited and small oil-water interface . The above reasons increa the difficulty of preparing the submicron Pickering emulsions . The purpo of this study is to prepare stable submicron-sized Pickering emulsion by utilizing the natural polysaccharide with good biocompatibility-cellulo nanocrystals (CNCs ) as particle emulsifier , squalene as oil pha . The effects of preparation conditions such as particle concentration , oil-water ratio ,aqueous pha , ultrasonic time and frequency on size distribution and stability o f Pickering emulsions were investigated . Finally , the submicron-sized Pickering emulsion (CNCs -PE ) with good storage stability and centrifugal resistance was prepared，and the average size o f CNCs-PE was about 638.7±8.40 nm . The confocal lar scanning microscopic (CLSM ) images revealed that Pickering emulsion was formed successfully by the adsorption of CNCs on the oil-water interface . The cytotoxicity of CNCs and CNCs stabilized Pickering emulsion (CNCs -PE ) was evaluated using CCK -8 method , and it showed that there was no significant loss o f cell viability . In addition , the vaccine formulation was prepared by absorbing antigen protein -OVA .
The adsorption efficiency of OVA was about 80%, and the histological micrographs of the intramuscular injection site ction also showed the injection safety . It is expected to expand the applications of submicron-sized Pickering emulsion bad on CNCs in biomedicine fields .
Key words ： cellulo nanocrystals ; ultrasonic ; submicron Pickering emulsion ; stability o f emulsion ; biocompatibility
收稿：2020-04-26，修回：2020-06~0丨，网络发表：2020~06-16，Kecfived: 2020-04-26, Revid: 2020-0^-01，Published online: 2020~06-16 基金项目：中国科学院国际合作局国际伙伴计划项目(编122m K Y S B 20180021>
作者简介：屈艳玲(1993-)，女，陕西省安康市人，硕士研究生，生物化工专业，E-mail:*****************；吴颂，通讯联系人，E-mail:************.引用格式：屈艳玲，吴颉，马光辉.基于纤维素纳米晶稳定的亚微米Pickering 乳液制备.过程工程学报，2021,21(4): 454~462.
Q u Y L, W u J , M a G H. Preparation of submicron Pickering emulsion stabilized by cellulo nanocrystals (in Chine). Chin. J . Process Eng.,
2021,21(4): 454-^62, DOI: l0.12034/j.issn.l009-606X.220141.
第4期屈艳玲等：基于纤维素纳米晶稳定的亚微米Pickering乳液制备455基于纤维素纳米晶稳定的亚微米P i c k e r i n g乳液制备
屈艳玲u，吴颉2'马光辉2
1.中国科学院大学化学工程学院，北京100049
2.中国科学院过程工程研究所生化工程国家重点实验室，北京100190
摘要.•与传统表面活性剂稳定的乳液相比，固体纳米颗粒稳定的Pickering乳液具有较强的界面稳定性、多功能性、低毒性等 优势，在生物医药领域具有较大的应用潜力。而相较于尺寸较大的微米级Pickering乳液，亚微米Pickering乳液具有更大的比表 面积、更有效的递送效率，有望进一步拓展Pickering乳液在生物医药领域的应用。但由于Pickering乳液的制备影响因素众多，且相互制约，刚性的固体颗粒难以在较小的有限油水界面排布，增加了亚微米Pickering乳液的制备难度。本工作以制备稳定的 亚微米Pickering乳液为研宄目标，采用具有良好生物相容性的天然多糖-纤维素纳米晶(C N C s)为颗粒乳化剂，角鲨烯作为油相，考察了颗粒浓度、油水比例、水相成分、超声时间及频率对Pickering乳液粒径分布及稳定性的影响，最终得到了具有良好的储 存稳定性和抗离心稳定性的粒径为638.7±8.40 n m的亚微米Pickering乳液(C N C s-P E)。通过激光共聚焦显微镜证实了 C N C s吸附 在油水界面，形成了 Pickering乳液结构。利用C C K-8法评价了 C N C s和C N C s-P E的细胞毒性，结
果表明，两者都具有良好的 细胞安全性。此外，将其用于吸附模型抗原O V A，吸附率达到约80%，且肌肉注射部位的切片结果也表明其注射安全性良好。此结果为亚微米Pickering乳液进一步研宄提供了参考，并有望拓展C N C s稳定的亚微米Pickering乳液在生物医药领域的应用。关键词：纤维素纳米晶；超声；亚微米Pickering乳液；乳液稳定性；生物相容性
中图分类号：T Q316.334文献标识码：A文章编4
1前言
Pickering乳液是一种利用固体颗粒代替表面活性 剂稳定油水两相界面的特殊乳液体系。与表面活性剂稳 定的乳液相比，Pickering乳液避免了表面活性剂可能引 起的刺激、溶血、环境污染等问题，安全性得到提高[1]。固体颗粒在液滴表面的吸附为不可逆吸附，极大地提升 了乳液的稳定性W。采用具有功能性、响应性的颗粒可 制备具有相同特性的乳液Pickering乳液作为功能 材料有望在生物医药领域发挥巨大潜力[〜。但目前报道 的Pickering乳液多为微米级别，制备Pickering乳液使 用的固体颗粒也多为生物相容性较差的刚性无机颗粒[8-叫，制约了 Pickering乳液的实际应用。更小的尺寸赋 予其更大的比表面积，有利于提高生物利用度、剌激响应 性，更适合于生物医药应用，如递送活性物质等且由于其尺寸降低，在贮存过程中可抵抗重力沉降、絮凝 和聚结，有望实现“近热力学稳定”【15，161。因此，制备 一种具有良好生物相容性的亚微米Pickering乳液具有 重要的研究价值和意义。
目前关于亚微米Pickering乳液制备多采用二氧化 硅纳米颗粒或采用二氧化硅纳米颗粒与表面活性剂协同稳定乳液。但这种添加了无机颗粒、表面活:1009-606X(2021)04-0454-09
性剂的乳液，其生物相容性有待提高。J in等提出了气相凝结法制备亚微米Pickering乳液，通过冷凝水蒸 气在含二氧化硅纳米粒子的冷油中扩散，液滴自发的在 油-空气界面处成核，纳米粒子吸附后形成小尺寸的 Pickering乳液，但这种方法只能形成油包水型Pickering 乳液，有一定局限性。
润湿性适宜的棒状颗粒更容易稳定油水界面，进而 形成更稳定的Pickering乳状液因为棒状颗粒在稳定油水界面时，棒状的取向不同而产生不同的排布方 式[24，M，更有利于稳定油水界面。纤维素纳米晶(Cellulo nanocrystals,CNCs)是一种来源广泛的生物友 好型固体纳米颗粒，可从植物、微生物和动物[27,28]中提 取，并可进行多种改性。C N C s通常采用硫酸酸解法制 备，具有高度的结晶结构，尺寸更短更均匀。同时，CNCs 表面具有带强负电荷的磺酸酯基(OSO勹，颗粒间的静 电斥力使颗粒具有很好的稳定性1281。由于其具有无毒性 和生物降解性等优点，C N C s作为一种极具潜力的颗粒 乳化剂，在生物医药领域有着广泛的应用[29]。
本研究采用CN Cs为乳化剂，以制备稳定的亚微米 Pickering乳液为研宄目标，研究了颗粒浓度、油水比、水相条件、超声制备条件等对Pickering乳液粒径的影 响。并对该亚微米Pickering 乳液的离心稳定性和储存
世界第三高楼
456过程工程学报第21卷
稳定性进行评估，进一步考察其细胞毒性，以探宄其在 生物医学领域的潜在应用。
2实验
2.1材料与试剂
纤维素纳米晶(CNCs，分析纯，上海闪思科技有限 公司)，角鲨烯(色谱纯，美国Sigma公司)，异硫氰酸罗 丹明 B(IsothiocyanateRhodamineB，RBITC，相对分子质 量536.08，北京酷来博科技有限公司)，磷酸盐缓冲液 (PBS,lx，0.01 mol/L,pH=7.2〜7.4)和磷钨酸(2%)购于 北京索莱宝科技有限公司，三羟甲基氨基甲烷(相对分 子质量121.14，纯度彡99.5%)、柠檬酸钠(相对分子质量 294.10，纯度彡99.0%)、磷酸氢Ilfft(Na2HP04.12H20, 相对分子质量358.14，纯度多99%)、磷酸二氢钠(NaH2P042H20，相对分子质量156.01，纯度彡99%)均 购于国药集团化学试剂有限公司，盐酸(相对分子质量 36.46，纯度36.0%〜38.0%，北京化工厂)，鸡卵清白蛋白 (OVA，色谱纯，美国Sigma公司)，Micro B C A蛋白检 测试剂盒(分析纯，美国Thermo Scientific公司)，BALB/c 小鼠(雌鼠，北京维通利华实验动物技术有限公司)，去 离子水(实验室自制，优普18.25 M Q超纯水净化系统)。
2.2实验设备与分析仪器
SB25-12D T D超声波清洗机(宁波新芝生物科技股 份有限公司)，SFX550超声破碎仪(美国Branson公司), BS I10s电子天平(德国Sartorius公司)，普通碳支持膜 铜网(200目，北京中镜科仪技术有限公司)，高速离心机 (3K30美国Sigma公司)，Scepter 1.0细胞计数器(德国 Merck公司），Infinite M2000 酶标仪(瑞士 Tecan公司），Zetasizer Nano Z S动态光散射粒度仪(英国Malvern公 司)，JEOL4100-Flash透射电镜(TEM，日本电子株式会 社)，A1激光共聚焦显微镜(CLSM，日本尼康)。
2.3实验方法
2.3.1 C N C s的表征
称取适量CN Cs加入去离子水中，超声3 min进行 预处理，得到澄清的CN Cs分散液。利用动态光散射粒 度仪(DLS)测量CN Cs分散液的尺寸分布和Zeta电位。用透射电镜观察CN Cs形貌结构。取20 nL C N C s分散 液(0.1mg/mL)滴加到铜网上，然后滴加]20 n L憐销酸静 置3〜5 min，用滤纸吸去多余的染料，室温下干燥后用 TEM观察。从T E M图中分析得到C N C s的平均长度、宽度和形貌等信息。
2.3.2亚微米Pickering孚L液制备
Pickering乳状液的制备过程如图1所示。向含不同 质量分数CNCs纳米颗粒的水相中加入一定比例的油相 -角鲨烯。然后在不同的超声功率和超声时间下对混合 物进行超声乳化，即可得到Pickering乳液。
Oil pha W a ter pha
squalene C N C s
Pickering emulsions 图1C N C s为颗粒乳化剂制备Pickering乳液的流程示意图 Fig. 1Schematic reprentation of the Pickering emulsions process using C N C s as the particle emulsifier
2.3.3亚微米Pickering乳液的表征
(1)乳液类型
取一滴乳液加入去离子水或角鲨烯中，观察乳液是 否能分散均匀。如果乳液能在水中很快分散，表明制备 的乳液为O/W型Pickering乳液。反之如果能在角藍稀 油相中快速分散则为W/O型Pickering乳液。
(2) 粒径和电位测定
采用动态光散射粒度仪测量所制的Pickering乳液 的粒径分布和^电势。将制得的Pickering乳液用去离子 水稀释100倍后取1m L加入样品池中，置于动态光散 射粒度仪样品槽中，测定乳液的粒径大小和分布(PDI 值)，每次测定前平衡60s，每次测量至少累计12次，每个样品平行测量三次。（电势的测量方法同粒径测定 方法。
(3)乳液结构
参照Nieln等[3D】的方法用RBITC对CNCs进行荧 光标记。采用荧光标记后的纤维素纳米晶(RBITC- CNCs)在相同制备条件下制备Pickering乳液，适当稀释 后置于载玻片上，小心盖上盖玻片后，倒置于100 x的油镜，在目镜下找到焦平面后选择合适的荧光通道观察 (543 nm激发，570〜610 n m发射)乳液的结构。
2.3.4亚微米Pickering乳液稳定性考察
(1) 离心稳定性
平均值函数将上述制备的乳液分装于离心管内，6000 r/min下 离心lO m irn不分层说明乳液制备成功，且乳液具有良 好的抗离心稳定性。
(2) 储存稳定性
将制得的新鲜乳液分装于离心管中，分别于
4,25
第4期屈艳玲等：基于纤维素纳米晶稳定的亚微米Pickering 乳液制备457
和37°C 静置，每隔一定时间观察乳液的外观状态，判断 有无分层现象，并对其进行粒径分布和纟电位测定，测 定方法同前，观察乳液在不同储存条件下的稳定性。液，取下清，采用Micro B C A 试剂盒测定下清中的蛋白 含量，即乳液未吸附的抗原OVA 。则乳液对O V A 的吸 附率(Adsorption Efficiency , AE )按以下公式计算：
2.3.5亚微米Pickering 乳液体外细胞毒性
实验采用CCK -8试剂盒检测C N C s 颗粒及其稳定AE (%)
总8A 0VA 的量-未吸Pffc >VA 的量
总投入OVA 的量
x l O O %
(2)
的亚微米Pickering 乳液的细胞毒性，测定原理如下：在 电子耦合试剂的作用下，水溶性四唑盐被细胞中的一些 脱氢酶还原生成橙黄色的产物，颜色深浅和细胞数目呈 线性关系。细胞毒性越大，颜色越浅，反之细胞増殖越 多，颜色越深。将培养的J 774细胞计数后调整为浓度为 在5x l 05cells /m L 的细胞悬液，接种于96孔板。实验孔 和对照孔中分别加入细胞10〇nL /?L ，置于37°C 的细胞 培养箱中培养一段时间，待细胞贴壁后，向实验孔中加 入含不同浓度CN Cs 或CNCs -PE ，对照孔中加入等量培 养基，继续培养24 h 。之后向培养板中每孔加入10 nL 的CCK -8溶液，继续培养3 h 后用酶标仪测定450 nm 处的吸光度。则其细胞毒性用细胞存活率(Cell viability , R )表示，
越高，表明其毒性越小。F 〇=[(U
〇)A 4C —帅1〇〇%
(1)爱心盒子怎么折
式中，次是含CCK -8溶液、细胞和待测物的孔的吸光 度值，人是含CCK -8溶液、细胞和培养基的孔的吸光 度值，戌是含CCK -8溶液和培养基而没有细胞的孔的 吸光度值。
2.3.6亚微米Pickering 乳液对抗原的吸附
以OVA 为模型抗原，取制备的新鲜Pickering 乳液 1 mL (含C N C s 的量为3 mg )加入100 ng OVA ，在室温 环境下垂直混合(15 r /min )过夜。然后取垂直混合吸附后 的乳液抗原混合液，离心(10000xg , 5 min )后弃掉上层乳
2.3.7亚微米Pickering 乳液注射安全性
将BALB /c 雌性小鼠进行随机分组，每组8只，按 动物免疫方案进行肌肉注射免疫，分别于免疫第1天、 第3天、第7天分批处死小鼠，取出注射部位的肌肉组 织，用4wt %的多聚甲醛溶液固定后制成石蜡切片，然 后用苏木精和伊红染色(H E 染色)，于显微镜下观察炎症 反应。
2.3.8实验动物伦理说明
本实验中所购买的动物小鼠饲养于中国科学院过 程工程研宄所S P F 级别无菌动物房，每日保证充足的 SPF 级别小鼠饲料和无菌水喂养，且每次实验前，新购 置的小鼠都在动物房内适应环境约一周。本实验中的动 物实验方案均通过了中国科学院过程工程研宄所动物 房的伦理审查委员会审核。
3 结果与讨论
3.1 CNCs 表征遵义会议的意义
超声处理后的CN Cs 悬浮液澄清透明。D L S 结果显 示，C N C s 纳米颗粒的尺寸为95_29±1.7nm , Z eta 电位 为 42.6 士 6.51 mV 。
同时用透射电镜观察C N C s 的形态。从T E M 图(图 2)中可以看出，纤维素纳米晶体呈棒状结构，长度约为 50~200 nm ，宽度为 5~20 nm 。
图2
C N C s
的透射电镜照片
Fig.2 T E M images of C N C
s
458过程工程学报第21卷
Oil-water ratio
图5不同油水比下的Pickering 乳液粒径
Fig.5 Particle sizes of Pickering emulsions prepared with
南艺研究生处different oil-water ratios
3.2.3水相条件的影响
分别用去离子水、Tris -H C l 缓冲液、磷酸缓冲液
(PBS )和柠檬酸盐溶液(CPBS )为水相制备Pickering 乳 液，但除去离子水外，采用其余水相缓冲液所制备的 Pickering 乳液稳定性较差，且粒径增大(图6)。
其他缓冲离子的加入会屏蔽C N C s 表面的双电子 层，进而影响其润湿性，粒子相互缠绕叫使CN Cs 更 难吸附到油水界面，从而聚集成较大尺寸的液滴以保持 乳液稳定。去离子水成为制备亚微米Pickering 乳液最
图4
C N C s
浓度影响Pickering 乳液尺寸示意图
Fig.4 Schematic diagram of the influence of C N C s
concentration on Pickering emulsion size
3.2.2油水比例的影响
将CN Cs 的含量保持在1.2wt %，调节油相角鲨烯的 比例分别为1:9, 2:8, 3:7, 4:6, 5:5, 6:4，都能得到均一的 乳白色乳液。继续增加油相比例，超声后逐渐有油相析 出，乳液稳定性变差。由图5可以看出，随油相比例增 大，乳液的尺寸也逐渐增大，当油相增加时，需要用于 稳定乳滴界面的颗粒数也随之增加。如CN Cs 的浓度不 足以稳定大量的油相液滴时，液滴碰撞频率就会增加， 以达到减少界面总面积从而维持稳定的目的，使凝聚的 可能性增加，进而增大了乳滴的尺寸。确定制备 Pickering 乳液的最佳油水比为1:9。
0.0
0.3
人间清欢
0.6
0.9
1.2
1.5
1.8
Particle concentration/wt%
2.1
图3不同颗粒浓度下的Pickering 乳液粒径
Fig.3 Particle sizes of Pickering emulsions prepared with
different particle concentrations
3.2 CN Cs 稳定的Pickering 乳液制备条件优化
将不同质量分数的CNCs 悬浮液和油相混合体系超 声制备Pickering 乳液。乳液呈均一的乳白色，乳液能在 水中快速分散，表明制备的乳液均为0/W 型Pickering 乳液。这是因为该CN Cs 颗粒是通过硫酸酸解方法制备 得到的，通过测量其三相接触角为52.4°，表明其亲水性 强于亲油性，倾向于形成更加稳定的水包油型Pickering 乳液。
3.2.1 CNCs 颗粒浓度的影响
乳液的尺寸受颗粒浓度影响较大(图3)。起初随颗 粒浓度增加，乳状液粒径不断减小。这是因为CN Cs 浓 度增加导致更多的颗粒吸附到油水界面，形成紧密的网 状层，包裹的有效界面面积增大，且液滴表面形成较厚 的界面膜，也有效防止了油滴之间的凝结变大，最终形 成较小尺寸的乳滴然而，当CN Cs 悬浮液质量分数 增至1.2wt %时，乳液粒径己达最小限制值。此时，即使 C N C s 浓度增加，乳液的尺寸也不再继续减小。对于 Pickering 乳液，水相中固体粒子的增加会降低界面张 力，直到体系达到稳定的最高临界点[32]。当颗粒质量分 数增至l .2wt %时，因为C N C s 的尺寸和性质限制，乳液 的粒径减小且达到最小值。此时，进一步增加CN Cs 的 用量，乳液的粒径基本不再变化，且此时乳液的粒径也 不再由固体粒子的浓度所决定，而多余的粒子存在于连 续相中，轻微聚集，导致乳液粒径稍微增大，但总体保 持稳定。CN Cs 浓度对Pickering 乳液尺寸的可能影响机 制如图4。乳液尺寸受颗粒浓度影响较大，但当液滴表 面的颗粒数量达到饱和时，即使颗粒浓度继续增加，乳 滴尺寸也不再变化。
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