标 准 操 作 规 程
目的：为了使Chromaflow层析柱装柱过程可重复，并能够得到较好的柱效，故建立此操作规范。
范围：配合ÄKTA process或Uvis-920手动系统进行有效的蛋白质纯化操作。
责任人：层析工序操作人员
标准操作程序：
1、方法描述
1.1在位装填技术（packing-in-place）是专门针对Chromaflow层析柱的新型装柱方法，它利用特殊的喷嘴（nozzle）将填料装进柱体，因此在每次装柱和拆柱的过程中就不需要移动柱体和柱头。本标准的操作流程可以适用于不同填料装于不同规格的Chromaflow层析柱中。
1.2本操作流程以填料Q-Sepharo BB为例，将其快速有效地装入Chromaflow 400层析中，柱高为30cm。
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2、材料和设备
Chromaflow 400层析柱（内径40cm，带有50µm不锈钢筛网）；
装柱站（packing station）；
不锈钢储罐2个（分别装纯水和胶悬液slurry）；
10mm ÄKTAprocess系统或手动系统（Skid）；
4路2通阀（10mm）；
压力表（0-60psi）；
TC接头卡箍和垫片若干；
连接管道若干；
贾平凹散文集压缩空气；
50-70%浓度的Q-Sepharo Big Beads slurry（纯水中）；
纯水和20%乙醇；
1%丙酮水溶液（V/V），0.4 M NaOH和2 M NaOH水溶液.
3、准备工作
3.1 柱体调水平
3.1.1 配件连接
将三通连接到MPT上，并在其他2个出口依次连接压力表和4路2通阀，在底部MPB上连接4路2通阀，将阀门的其他出口依次连接管道备用。利用合适的管道和配件将柱子的nozzles和packing station（图2）以及水、slurry的储藏罐相连。将packing station和压缩空气相连。用20%乙醇侵润柱头和密封圈，以便调节柱头高度。
3.1.2 柱头高度调节
关闭MPT和MPB，并将顶部和底部nozzle分别调至UNPACK和PACK位置（图1）。利用packing station（图2）调节handle至B和SIB位，将柱体内装满水，缩回顶部nozzle至RUN
位置。将支持顶部柱头的螺丝拧松来调节柱头高度。要升高柱头，就利用packing pump从底部nozzle将水泵入柱体。要降低柱头，将底部nozzle调至UNPACK位置，顶部为RUN位置，并利用unpacking pump将水泵出同时产生吸力使柱头降低。在柱头高度调节的过程中，利用水平仪时刻关注柱头各边的高度，并精确测量管道顶部法兰和柱头法兰之间的高度，确保各边高度一致，顶部和底部nozzle均调至RUN位置。柱头高度调节完毕后，拧紧各个螺丝。
好记星广告3.1.3筛网排气泡和观察密封性
东南亚第一大城市调节顶部和底部nozzle分别处于PACK和RUN位置，向柱体内泵入水，观察top nozzle的筛网上是否存在气泡，若有气泡调高泵速从而加大流速来除去气泡，若还有气泡，这时将底部nozzle调至UNPACK位，使水从SOB管路流出直到水面脱离筛网，再调底部nozzle至PACK位使水慢慢侵没筛网从而可保证除去筛网上气泡；继续泵入水使压力接近3bar，将底部nozzle至RUN位，观察10-20min，如果压力保持不变则表明柱子的密封性是合格的；这时迅速打开底部MPB阀门放水再迅速关上，重复2-3次即可排除下筛网腔内气泡。同法排除上筛网腔内气泡。
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图1、Chromaflow nozzls三种工作位置示意图
3.2 胶悬液（slurry）准备
3.2.1 slurry浓度及体积确定
将slurry充分搅匀后，取适量于2ml或更大离心管中，适当离心后观察填料体积和总体积的比例确定slurry浓度，最终确定slurry的浓度为50%。以下面的公式来计算需要的slurry体积：
L为柱高，CF(compression factor)为填料的压缩因子，Ac为柱体的横截面积，Cslurry为slurry的浓度。
在此例子，L=30cm，Q-Sepharo BB的CF=1.15，Ac=1256cm2，Cslurry=50%，则：
Vslurry=30*1.15*1256/0.5 mL=87000mL=87L.
图2nba历史总得分榜排名、Packing station流程示意图
3.2.1 管道中slurry体积确定
反法西斯战争 确定以下组件中的所需的slurry死体积ECV（External Components
Volume）：slurry储罐到packing station管路，packing pump，packing station到SIT管路，SOT到packing station管路，packing station到slurry储罐管路。ECV的确定可以直接根据管道的长度和直径来计算，也可以把组件中充满水再利用量筒来测量水的体积。一般情况下，ECV不会超过2-3L，将这2-3L的slurry加到slurry储罐中作为总的Vslurry。
4、层析柱装填
4.1 利用顶部nozzle装填法
4.1.1 将顶部nozzle调至RUN，将SOT管道放于slurry储罐，利用packing station将顶部nozzle和管道中充满slurry以排除气泡。将顶部nozzle调至PACK，打开MPB阀门，转动handle打开packing pump，并利用微调旋钮使packing station面板上压力表显示为3.5bar，
但由于气动压力表的指针会有波动，那么就保证波动范围为3.2-3.6bar，同时可利用秒表和量筒来测定MPB出口的液体流速，依次作为反馈来调节泵速。
4.1.2 在packing的过程中，利用搅胶棒搅匀slurry储罐中的胶悬液以免填料沉积下来，但是同时需避免产生漩涡，因为漩涡会会容易将气泡泵入柱内。
4.1.3 一旦slurry储罐中的胶悬液全部排空后，立即停泵，并同时调节顶部nozzle至RUN，关闭MPB出口。利用packing station泵入纯水排空回收所有管道中的残留slurry。
4.1.4 将column连接到skid上，调节流速至100L/h，并采用UPFLOW和DOWNFLOW的流动方向分别走1-2CV的纯水，这样可以进一步排除筛网气泡和稳定胶床。
4.2 利用底部nozzle装填法
4.2.1 将底部nozzle调至UNPACK，利用unpacking pump将柱体内水排完后再将nozzle调至RUN，利用packing station将底部nozzle和管道中充满slurry以排除气泡。将底部nozzle调至PACK，顶部nozzle调至UNPACK关闭MPT和MPB阀门。打开packing pump，调节压力表使波动范围为3.2-3.6bar。
4.2.2当slurry充满柱体并可以看到从SOT流出时，停泵并立即调节两个nozzles至RUN。利用packing station泵入纯水排空顶部和底部nozzles所有管道中的残留slurry，调节顶部nozzle至PACK，打开MPB排废。打开packing pump，调节压力表使波动范围为3.2-3.6bar。
4.2.3 在packing的过程中，利用搅胶棒搅匀slurry储罐中的胶悬液以免填料沉积下来，但是同时需避免产生漩涡，因为漩涡会容易将气泡泵入柱内。
4.2.4 一旦slurry储罐中的胶悬液全部排空后，立即停泵，并同时调节顶部nozzle至RUN，关闭MPB出口。利用packing station泵入纯水排空回收所有管道中的残留slurry。
4.2.5将column连接到skid上，调节流速至100L/h，并采用UPFLOW和DOWNFLOW的流动方向分别走1-2CV的纯水，这样可以进一步排除筛网气泡和稳定胶床。
5、柱效测定漏网
图3、柱效测定示意图
5.1 利用ÄKTAprocess测定柱效
5.1.1 连接。在MPT的4路2通阀上横向连接一根管道，另一端连至ÄKTAprocess连接口COLUMN TOP，同时从MPB的4路2通阀横向接出一根管道至ÄKTAprocess的连接口COLUMN BOTTOM。
5.1.2 平衡。将A1接口管道放入0.4M NaCl溶液中，将MPT的4路2通阀调至管路与大气相
连状态，在UNICORN的system control窗口点击manual→valves→InletA，选择inletA1，inrt；InletB，选择clod，inrt；Column，选择downflow，inrt；Pump→Flow，再设定高流速（如180L/h），点击execute运行，排完气泡再将阀调至管路与柱头相连状态，平衡3-5个CV至电导曲线稳定，点击END；
5.1.3上样。将B1接口管道放入2M NaCl溶液，将MPT的4路2通阀调至管路与大气相连状态，在system control窗口点击manual→valves→InletA，选择clod，inrt；InletB，选择InletB1，inrt；Column，选择downflow，inrt；Pump→Flow，设定高流速（180L/h）点击execute运行，排完气泡，执行pau；
