第二十一章 基因诊断与基因治疗
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Gene Diagnosis and Gene Therapy
一、授课章节及主要内容：第二十一章 基因诊断与基因治疗
二、授课对象：临床医学、预防、法医（五年制）、临床医学（七年制）
三、授课学时
本章教学共1学时。讲授安排如下：基因诊断0.5学时，基因治疗0.5学时。
四、教学目的与要求
通过本章学习，从整体上了解基因诊断和基因治疗的基本概念、基本理论。了解内源基因变异和外源基因入侵是导致人类致病的两大类因素。了解基因诊断和基因治疗常用技术方法的类型和基本知识，了解基因治疗的基本程序。
一代文豪林黛玉五、重点与难点
重点：掌握基因诊断、基因治疗的概念和理论。
难点：① 限制性内切酶酶谱分析法原理。② DNA限制性片段长度多态性及其用于基因诊断的原理。③ PCR/单链构象多态性分析。④ 基因灭活的几种方法。 ⑤ 基因治疗的载体。
六、教学方法及授课大致安排
教学方法：主要是自学形式，讲授基因诊断与基因治疗的概念。
授课大致安排：前言3分钟，基因诊断概念2分钟，诊断方法15分钟；基因治疗概念2分钟，方法15分钟，基因治疗的基本程序8分钟。
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七、主要外文专业词汇
gene diagnosis,gene therapy,RFLP,SSCP,gene chip,RNAi,triplex approach
八、思考题
1.什么是基因诊断？介绍基因诊断的常用技术方法。
2.简单介绍基因诊断的应用。
3.什么是基因治疗？简述基因治疗的方法。
4.基因灭活的主要方法有哪些？简述灭活的原理。
5.简述基因治疗的基本程序。
手机屏幕图片九、教材与教具:人民卫生出版社《生物化学》第六版
十、授课提纲(或基本内容)
概 述
Introduction
基因诊断与基因治疗是分子生物学理论和技术应用到临床医学所产生的新的诊断和治疗疾病的方法。这些新方法是现有诊断和治疗疾病手段的补充和扩展。随着分子生物学理论和
技术的新进展不断应用于临床医学研究，人们对疾病发生、发展的分子机理的认识也不断深入；从基因水平诊断疾病和治疗疾病已成为现代基础医学和临床医学研究的重要内容。随着科学研究的不断发展，基因诊断和基因治疗将会为人类健康带来更大的福音，为人类根治疑难绝症带来希望和曙光。下面分基因诊断和基因治疗两个方面给大家介绍这一章的内容。
第一节 基 因 诊 断
Section I Gene Diagnosis
{基因诊断} 是指利用分子生物学技术和方法直接检测基因结构及其表达水平是否正常，从而对疾病作出诊断的方法。从基因水平而言，导致人类致病的因素有两大类：
① 机体自身基因（即内源基因）的变异，包括基因结构突变和基因表达异常。
② 病原体基因（即外源基因）的入侵。在分子生物学技术建立之前，我们无法直接鉴定基
因的缺陷，只能通过缺陷基因所导致的表型症状或根据缺陷基因引起的各种生化指标或其它辅助检查指标的改变对疾病作出诊断。随着分子生物学技术的发展，现在我们可以采用分子生物学技术直接检测和鉴定是否有内源缺陷基因或外源基因的存在，使疾病的诊断在传统的表型诊断基础上增加了基因诊断的内容，从而使许多疾病的诊断更迅速、更精确。
基因诊断与传统诊断学方法的不同之处在于它是直接以基因作为探查对象。因而，它具有与其它诊断学方法完全不同的特点：① 针对性强：因为基因诊断是直接以基因为检测对象，对病因诊断的针对性强。② 特异性强：基因诊断采用的分子生物学技术（核酸分子杂交、PCR等）都能精确地分析特定基因中的特定序列的结构、或特定基因的表达水平，因而具有很强的特异性。③ 灵敏度高：以往的诊断需要满足一定量的样品，对微量样品根本无法进行操作或不敏感，无法作出诊断。而分子杂交和PCR技术都能利用极少量的样品获得准确的结果，特别适用于疾病的早期诊断。 ④ 适用范围广：基因诊断即可检测出内源性基因是否异常，也可检测出人体内是否有外源性基因的存在，因此，能够用于许多疾病的诊断，在临床上适用范围广。
一、基因诊断常用技术方法：
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基因诊断常用技术方法包括两大类：一是DNA诊断技术；二是RNA诊断技术。DNA诊断技术包括：核酸分子杂交技术、PCR技术和DNA序列测定等；RNA诊断技术包括：RNA点杂交、Northern分析、定量PCR、mRNA差异显示PCR等技术。在这一节只介绍DNA诊断技术中几种常用的方法。
爱我中华1．核酸分子杂交技术
核酸分子杂交技术是基因诊断中的基本技术之一。它的基本原理是：单链核酸（DNA或RNA）能够在一定条件下与互补的单链核酸（DNA或RNA）结合形成双链。杂交可以在DNA-DNA、DNA-RNA、RNA-RNA以及DNA-寡核苷酸之间进行。因此，采用一段已知的核酸序列作为探针，可以探测未知样品中相应的核酸序列是否存在，如果样品中有同源序列存在，核酸探针就可以与同源序列中的互补序列结合形成双链，从而得知特定核酸的存在与否。如用一段白血病相关基因的DNA序列制备成探针（已知），去探测被检样品（未知），如果被检样品中存在与探针序列相同的DNA序列，探针就可与之结合形成双链，检测结果可作为诊断白血病的重要依据之一。
利用核酸分子杂交技术可以进行限制性内切酶酶谱分析、 DNA限制性长度多态性 (restricti
on fragment length polymorphism， RLFP)分析，在杂交中利用等位基因特异寡核苷酸探针(allele specific oligonucleotide ，ASO)还可以分析特定基因中的突变位点。这里我们只介绍前两种。
（1）限制性内切酶酶谱分析法：
此方法是利用限制性内切酶和特异性DNA探针来检测是否存在基因变异。图22-1所示为β珠蛋白的基因。当该基因第六个密码子发生A→T突变时，所编码的氨基酸从谷氨酸被改变为缬氨酸，因而导致镰状细胞贫血症。该突变同时也造成DNA序列中的一个 MstⅡ限制性酶切位点丢失，利用这一特定可进行基因诊断。将正常人和带有突变基因个体的基因组DNA分别用Mst Ⅱ酶消化后，凡是基因组上具有MstⅡ位点的地方都会被切断，酶切后得到大小不等的片段。所有这些片段可通过电泳进行分离。
在电泳过程中，各个片段可按大小分离开来。由于我们提取的是基因组DNA，在进行凝胶电泳时，每条带的量是很少的，电泳后的条带是完全看不见的。通过核酸分子杂交可以显示特定DNA片段。利用β珠蛋白基因的DNA探针可显示出该基因的DNA片段。在图21-1（见六版教材图21-1）中所示，β珠蛋白基因有MstⅡ位点，因此该基因的DNA序列被切断，金刚坐正确坐姿图片
杂交后显示出2个DNA片段（1.15Kb和0.2Kb）。当突变使MstⅡ位点丢失后，该基因的DNA片段不能被切断，因而在电泳及杂交后只显示1个大的DNA片段（1.35Kb）；如果是杂合子，杂交后就会显示3个DNA片段。因此，这种方法不仅可以诊断出是正常人还是患者，而且还可以诊断出是纯合突变还是杂合突变。
图21-1 镰状红细胞贫血患者基因组的限制性酶切分析
（2）DNA限制性片段长度多态性（ restriction fragment length polymorphism, RFLP）
在人类基因组中，平均约200对碱基可发生一对变异（称为中性突变，）中性突变导致个体间核苷酸序列的差异，称为DNA多态性。突变、重排、单个核苷酸的插入或缺失可使DNA顺序发生改变。其中有些可能造成限制酶切位点的增加、缺失或易位，致使DNA分子的限制酶切位点数目、位置发生改变。用限制酶切割基因组时，所产生的限制性片段的数目和每个片段的长度就不同，这就是限制性片段长度多态性。
在某一特定家族中，如果某一致病基因与某一特异的多态性片段（ DNA多态性或限制性片段长度多态性）紧密连锁，就可以用这一多态性片段作为一种“遗传标志”，来判断家庭成员或胎儿是否为致病基因的携带者。用“遗传标志”基因作为探针，进行杂交检测就可判断致病基因的存在与否。
2. PCR/单链构象多态性分析 (single strand conformation polymorphism， SSCP)
PCR/SSCP是一种快速检测基因突变的方法，其基本的原理是：单链DNA呈现复杂的构象，而这种立体构象主要是依靠单链内碱基配对等分子内相互作用维系的。相同长度的单链DNA因碱基序列不同，甚至只是一个碱基不同，都可以形成不同的空间构象，在电泳时泳动的速率不同。进行该项检测，首先是利用PCR技术对待测基因片段进行扩增，分别获得正常对照DNA的PCR产物和待测DNA的PCR产物，然后将DNA变性成单链，采用非变性聚丙烯酰胺凝胶进行电泳分离。单链DNA在非变性聚丙烯酰胺凝胶中形成不同的构像。在电泳过程中，长度相同而构像不同的单链DNA分子在凝胶中的泳动速率不同。如果待测DNA没有发生突变，其序列与正常对照DNA一致，电泳后在凝胶中的位置就会与正常对照组DNA的每一条带的位置完全一致。如果待测DNA中有突变，电泳后就会出现位置不同的条带。借此分析是否有致病基因的存在。
Leber 遗传性神经病患者是由于线粒体DNA第11778位碱基（G→A）突变所致。用PCR方法获得正常和待测线粒体DNA片段后，再作SSCP分析（图21-2 见六版教材图21-2），可见待测DNA的电泳后条带与正常DNA对照条带不一致，说明该基因存在有突变。
图21-2 Leber病患者PCR/SSCP分析
二、基因诊断的应用
目前基因诊断已广泛应用于下列疾病的诊断：如遗传疾病、肿瘤、各种感染性疾病、传染性流行病以及用于判断个体疾病易感性、器官移植组织配型、法医学中个体识别、亲子鉴定等。由于基因诊断具有其它诊断学方法所不具备的特点，它将在遗传病的防治、肿瘤的早期诊断、爆发性感染性疾病的预测等方面将发挥越来越大的作用。
第二节 基因治疗
折损的意思Gene Therapy
目前已知许多人类疾病与特定的某个基因或某些基因有关，常常涉及到人体内基因的变异或基因表达的异常以及外源基因的入侵。因此，从基因水平消除病因将成为未来医学的一个重要发展方向。
一、 基因治疗的定义
基因治疗在早期是指用正常的基因整合入细胞基因组，以校正和置换致病基因的一种治疗方法。随着分子生物学方法和技术的不断发展和完善，基因治疗的内涵已有了很大的发展。从广义上来讲，基因治疗是指将某种遗传物质转移到患者细胞内，使其在体内发挥作用，以达到治疗疾病目的的一种治疗方法。
基因治疗采用方法基本上可以分为以下几种：
1.基因矫正（gene correction）
基因矫正是指将致病基因的异常碱基进行纠正，而正常部分予以保留。
2.基因置换（gene replacement）
基因置换是用正常的基因通过体内基因同源重组，原位替换病变细胞内的致病基因，使细胞内的DNA完全恢复正常状态。基因置换是基因治疗的一种最为理想的方法。但由于这种方法需要采用同源重组使相应的正常基因定位导入受体细胞的基因缺陷部位。而定位导入的自然发生率约为1/100万，因此，由于技术原因，这种治疗方法目前还难以实施。
