国际生物制品学杂志 2020 年12 月第 43 卷第 6 期Int J Biologicals，December 2020，Vol. 43，No. 6• 287 •
•论著•多重实时定量PCR检测G1—G4型轮状病毒
方法探索
王云瑾1周旭2白慕群1傅生芳1胡广宏1王名强1李雄雄1寇桂英1包红1
马超1
1兰州生物制品研究所有限责任公司第二研究室，甘肃省疫苗工程技术研究中心730046;
2上海生物制品研究所有限责任公司201403
通信作者：马超，Email:
【摘要】目的对多重实时定量PCRCreal-time quantitative PCR，qPCR)进行反应体系筛选和方法
探索，使其用于G1—G4型轮状病毒V P7基因的快速分型和定量分析。方法设计G1 — G4型轮状病
毒V P7基因特异性引物和探针，以特异性体外转录R N A为模板，筛选多重qPCR反应体系，建立多重
qPCR方法。采用单因素方差分析和配对样本£检验对多重与单重qPCR检测结果进行比较。结果
经筛选，得到6组三重qPCR反应体系和1组四重qPCR反应体系。所建立的三重和四重qPC R中，除
四重qPCR的G1型参数〔标准曲线决定系数0?2)为0. 982、扩增效率为89. 22〗％〕略低于要求外，其余
标准曲线尺2均>0.99，扩增效率均在90%至110%之间；检测灵敏度达102拷贝/>1。多重与单重qPCR
检测同一样本的相关性较好(尺2>0. 95)。三重与单重qPCRG值为1. 420〜25. 786)、四重与单重qPCR
G值为2. 505〜4. 851)检测结果间的差异均无统计学意义（P值均>0. 05)。结论建立的多重qPCR
可同时对3种以上目的基因进行分型和定量检测，为未来多价轮状病毒疫苗及混合病毒样本中毒株的
快速分型和定量检测方法的建立提供了借鉴。
【关键词】轮状病毒；聚合酶链反应；体外转录
DOI：10. 3760/cma. j. cn311962-20200824-00083
The method exploration of multiplex real-time quantitative PCR for detection of type G1-G4 rotavirus
Wang Yunjin1, Zhou X u2 , Bai Muqun1, Fu Shengfang1>Hu Guartghong1, Wang Mingqiang1, Li
Xiongxiong^, Kou Guiying1, Bao H ong1, Ma Chao1
iNo. 2 Rearch Laboratory，Lanzhou Institute o f Biological Products Co.，Ltd.', Center fo r Gansu
Provincial Vaccine Engineering Rearch，Lanzhou 730046，China; 2 Shanghai Institute o f Biological
Products Co.，L td.，Shanghai 201403，China
Corresponding author x MaChao^ Em ail：**************
【Abstract】Objective To screen reaction system and explore method of multiplex real-time
quantitative PCR (qPCR) for rapid genotyping and quantitative testing VP7 genes of G1-G4 rotavirus.
Methods Primers, probes and in vitro transcripted RNAs specific for VP7genes of G1-G4 rotavirus
were ud to screen multiplex qPCR reaction systems and establish multiplex qPCR methods. The
detection results between multiplex qPCRs and simplex qPCR were compared by one-way ANOVA and
paired-sample r-test. Results After screening, 6 reaction systems of triplex qPCR and 1reaction system
of quadruplex qPCR were obtained. The triplex qPCR and quadruplex qPCR were established with
determination coefficients (i?2) of standard curves >0. 99, amplification efficiencies ranging from 90% to
110%, except for type G1 in quadruplex qPCR (R2= 0. 982, amplification efficiency = 89. 221 %) slightly
below the requirement. The detection nsitivity was 102copies/^1. The correlation was good (R2 >
0. 95) when the multiplex qPCRs and simplex qPCR were ud to detect same sample. There was no
significant difference in detection results between triplex qPCR and simplex qPCR {t=\. 420-25. 786, all
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P >0. 05) and between quadruplex qPCR and simplex qPCR (t = 2. 505-4. 851, all P >0. 05). Conclusion
The multiplex qPCR established is capable of typing and quantitative detection of more than 3 target
genes in the same reaction tube，providing a reference for the establishment of rapid typing and
quantitative detection of multivalent rotavirus vaccine and mixed virus samples in the future.
【Key words】Rotavirus; Polymera chain reaction; 饥的transcription
DOIs 10. 3760/cma. j. cn311962-20200824-00083
怎么搞定金牛男
轮状病毒属于呼肠孤病毒科轮状病毒属，基因 组由n个分节段的双链R N A组成，共编码6种结 构蛋白和6种非结构蛋白。基于VP4和VP7蛋白 的双重分类系统，轮状病毒至少被分为36个G型 和51个P型[1]，其中G1—G4和G9型在人群中的 流行最为广泛[w]。
轮状病毒的快速检测对于疾病诊断具有重要意 义。本研究采用TaqMan®和TaqMan®M G B探 针，靶向G l—G4型轮状病毒的V P7基因序列，筛 选多重实时定量 PCR(real-time quantitative PCR，qPCR)的反应体系，并对该方法用于G1— G4型轮 状病毒的快速分型和定量检测进行探索。
1材料与方法
1.1毒株和质粒
G1(Wa株）、G2 (LD9 株）、G3 (LS4/9 株）和 G4 (LH9株）型轮状病毒，测序正确的质粒pGEM-T-G1—G4 VP7，鉴定合格、浓度已知的G l—G4型轮 状病毒特异性体外转录R N A均由兰州生物制品研 究所有限责任公司第二研究室提供。
1.2主要试剂和仪器
一步法 qPCR试剂盒 One Step PrimeScript™RT-PCR KiUPerfect Real Tim e)购自曰本 Takara Bio公司；引物、TaqMan®和 TaqMan®MGB探针、7500 Real-Time PCR S y stem及耗材均购自美国Appli
ed Biosystems公司。
1.3体外转录RN A标准品的制备
以质粒pGEM-T-G l—G4 VP7为模板，用T7 体外转录系统制备体外转录RNA。采用G1—G4 型轮状病毒特异性体外转录RNA[4_5]，制备混合体 外转录标准品RNA234及RNA,234分别作为三重和 四重qPC R体外转录R N A标准品。
1.4多重qPCR引物/探针的设计
根据设备检测通道情况，针对VP7基因 (GenBank序列号如下，G1:Wa株，JX406755;G2: D S~1株，AB118023; G3: SA11株，K02028; G4: Hochi株，AB039035)设计引物和探针（表1)，并分 别对G1—G4型探针标记不同的报告基团和淬灭基 团。采用不同的引物/探针组合，以体外转录RNA 标准品为模板进行多重qPCR，筛选多重qPCR反 应体系，确保每个目的基因均有扩增且相互间无干 扰。最终根据实际检测需求确定三重和四重qPCR 反应体系各1组进行方法的建立。反应条件为42 °C 5 min;95 °C1()s;95 °C 5 s，58 X： 60 s，共 40 个循环。
表1G1—G4型轮状病毒V P7基因的引物和探针
型别引物/探针碱基序列扩增产物长度/bp G1型WATS4F： ACTTATGAAATATGACCAAAGTCTTGAAT
TA266 WATA4R ： CATCC A CT A T A GCT A A TTTCTC A TTCTC A
Probel41-V5；VIC-TC A TTTC A A A TG A GTCTACGTTTG-3' MGB
G2型DSTS2F： ATGGGAACAGACTGCACGG84 DSTA2R ： TGTGTTTACGTCX：GTAGTTTTGC
Probe221 5 ’V IC-CC A A TGCCT A A G G T T T03，MGB
Probe22357C Y5-TTGTCCACTC A A T A C A C A A A CCTT A GGC A TTGG-3；BHQ1
G3型SATS1 F ： G A CTGAGGCCGCG A CTG A193 SATA1R ： C A A TTGC A A CGTCGCGTC
Probe312 5 ’FAM-CG A T A ATTC A TGG A A A G A C A C-3，MGB
Probe3135’CY5-CGATAATTCATGGAAAGACACACTGTCACAAC-3，BHQ1
G4型HOTS4 F ： T A G A TTCGCTTCTGGTG A G A AGTTG244 HOTA4R： TTTTTCGCTATCAGCAACTGTTTC
Probe4415； NEI> A GT A GCTGTATTTGTCGTTTG A -3; MGB
国际生物制品学杂志 2()2()年 12 月第 43 卷第 6 期 Int J Biologicals，December 2020，Vol. 43，No. 6
• 289 •
4 5 6 7 8
lg 拷贝数/Hi
®
G1 型：/?2=0.982，扩增效率=89.221% G2型：/?2=0.994，扩增效申-=99.〇79% ^
G3型：/?2=0.996，扩增效丰.=98.887% 型：/?2=0.995，扩增效參=97.157%
探针浓度均为200 nmol /L 时，三重qPCR -组6具 有最低 C t (Ct 〇2 = 25. 58 ± 0. 02、Ctca = 20. 78 土 ()•()0、〇« = 22. 53 ± (>• 07)，因此后期三重 qPCR 的建立主要以该组合进行。当引物和探针浓度均
为200 nmol 几时，四重qPC R 中各型别之间无干 扰。
分别以体外转录标准品RNA234和RNA i 234为 模板进行三重和四重qPCR ，除四重q P C R 中G 1型 参数(标准曲线尺2 =0.982、扩增效率= 89. 221%) 略低于要求外，其余标准曲线记均>().99，扩增效 率均在90%至110%之间（图1)，表明方法建立基 本成功。
34「
G2型：Z^O.998，扩增效率=105.251%
32 (-
prepaymentG3型：/?2=0.992，扩增效率=104.455%
2
3
4 5 6 7
lg 拷贝数尔1
⑨
图1多重实时定量PCR(qPCR)检测G1 — G 4型轮状病毒体外转 录RNA 标准品的标准曲线A 三重qPCR B
四重qPCR
2. 3多重qPCR 的灵敏度
分别采用l(v 拷贝/f i l 体外转录标准品RNA 234
和RNA ,234进行三重和四重qPCR ，个别型别的检测 结果为阴性(数据略）。
采用1〇2拷贝/y 体外转录R N A 标准品的检 测结果见表3，所有型别均可检测。2.4多重qPCR 与单重qPCR 的相关性
采用多重和单重qPCR 对样本进行检测，检测 结果之间的差异无统计学意义(表4，5)。
多重和单重qPC R 检测同一样本的相关性较 好，尺2均>0.95(图2)。
1.5多重qPCR 方法的建立
确定最佳引物/探针组合后，以体外转录RNA 标准品为模板进行多重qPCR ，建立标准曲线。每 个浓度做3次。要求决定系数CR2)>0. 99，扩增效 率在90%至110%之间。1.6多重qPCR 的灵敏度验证
采用不同拷贝的体外转录R N A 标准品进行多 重qPCR ，验证方法的灵敏度。1. 7
多重qPCR 与单重qPCR 的相关性分析采用多重qPC R 和单重qPCR 对样本进行检 测，分析两种方法检测结果之间的相关性。样本 G 234_l — G 234-5为不同浓度G 2 + G 3 + G 4型轮状 病毒体外转录R N A 混合样本，G 1234-1 — G 1234-5 为不同浓度Gl + G 2 + G 3 + G 4型轮状病毒体外转 录RN A 混合样本。
1.8统计学分析
扩增曲线、标准曲线及样本循环阈值（cycle
threshold ，Ct )由 7500 Real-Time PCR System 自动 生成。
采用SPSS 13.()计算C t 的均值、标准差和相对 标准偏差。采用单因素方差分析检验方差齐性后， 用配对样本Z 检验分析多重与单重qPCR 检测结果 间的差异，P <〇.()5为差异有统计学意义。采用
Excel 2003作图分析两种方法的相关性，圮>0. 95 表明相关性较好。
2 结果
2. 1多重qPCR 探针筛选结果
经筛选，得到6组三重qPCR 和1组四重qPCR
探针组合(表2)。
表2
多重qPCR 探针筛选结果
方法
G 1型
G 2型
G 3型G 4型三重qPCR-组1Probe141-V Probe223Probe312
-三重qPCR-组2Probel41-V Probe223-Probe441三重qPCR-组3Probel41-V -Probe312Probe441三重qPCR-组4-Probe221Probe312Probe441三重qPCR-组5-Probe221Probe313Probe441三重qPCR-组6-Probe223Probe312Probe441四重qPCR
Probel41-V
Probe223
Probe312
Probe441
注：q P C R ：实时定量PCR ;-：无
2.2多重qPCR 方法的建立
三重qPCR 反应体系优化结果显示，当引物和
型
型型型
12 3 4
G
G G G I I
42086420033322222
1
• 290 •
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20
25 30
35
40
单重qPCR 循环阈值
®
151----------1----------1----------1----------'----------1
15
20
25 30
35
40
单重qPCR 循环阈值
⑧
注：q P C R ：实时定量PCR
图2多重和单重qPC R 检测同一样本轮状病毒体外转录R N A 结 果的相关性A
三重qPCR B
四重qPCR
3
讨论
qPCR 已被广泛用于病毒的快速检测[6]。目前 轮状病毒检测主要针对病毒VP 4、VP 6、VP 7、
N SP 3、JVSP 4和A /SP 5基因的保守序歹(J ，通用性 好，但多为单重定性检测[7_9]，用于病毒分型的多重
qPCR 相对较少[〜"]。本研究针对G l —G 4型轮状
病毒的VP 7基因序列，探索并建立多重qPCR ，用 于G1—G 4型轮状病毒的快速分型和定量检测。
通过筛选，共得到6组三重qP C R 和1组四重 qPC R 反应体系。经优化，分别建立了三重和四重 qPC R 方法。当采用多重qPC R 检测1(V 拷贝/M 1体 外转录RN A 标准品时，试验重复性差，个别型别未 检出；而检测1〇2拷贝/jLtl 标准品时，各型别均可检 出，试验内重复性较好，相对标准偏差为〇. 22%〜 1.16%。鉴于多重qPC R 反应体系较为复杂，且体 系的优化难度较大，出于准确性和可重复性考虑，最 终确定方法的检测灵敏度为1〇2拷贝/4。建立的三 重和四重qPC R 分别可对G 2—G 4和G 1—G 4型样 本进行有效检测，与单重qPC R 检测同一样本的相
表3
多重qPCR 检测102拷贝/p lG l —G 4型轮状病毒体外转录RNA 标准品的循环阈值(rz = 6)
G 1型
G 2型
G 3型
G 4型
歌曲追光者
刀広•r ± s
RSD/%J T 土 S RSD/%■T ± S RSD/%•r ± 5RSD/%
三重qPCR -30. 66 ± 0. 180.6029. 88 ± 0. 07
0. 2430. 15 + 0.130.47四重 qPCR
30. 84 ± 0. 33
1.08
31. 89 ±0.07
0. 22
29. 76 ± 0. 35
1.16
30.31 ±0.33
1.07
注：q P C R ：实时定量PCR; R S D ：相对标准偏差；-：无
表4三重和单重qPCR 检测不同浓度G2—G 4型轮状病毒体外转录RNA 混合样本的循环阈值(72 = 6，i ±0
G2型
G3型
G4型
汗平
三重qPCR
单重qPCR
三重qPCR
单重qPCR
三重qPCR
单重qPCR
G234-122. 81 ± 0. 09
23. 63 ±0.21
22. 90 ±0.0024. 46 ± 0. 3720. 84 ±0. 1920. 85 ±0.13G234-232. 77 土 0. 5733. 69 ± 0. 2727. 69 ± 0.
0029. 10 ±0.0427. 50 ±0. 1527. 74 ± (). 04G234-329. 88 ± 0. 2230. 94 ± 0. 2424. 43 ± 0. 0025. 78 ±0.3124. 17 ±0. 1324. 28 ±0. 18G234-427. 19 ±0. 2727. 82 ±0. 1021. 11 ±0.0022. 42 ± 0. 3720. 80 ± 0. 0020. 72 ± 0. 06G234-5
24. 05 ± 0. 24
24. 52 ±0. 15
17. 72 ±0.45
19. 31 ±0. 57
17. 50 ±0. 01
17. 60 ± 0• 13
之值
7.46825. 786 1.420P
值
>0.05
>0. 05
>0.05
注：q P C R ：实时定量P C R
表5
四重和单重q P C
R
检测不同浓度G 1 —
G 4型轮状病毒体外转录R N A
混合样本的循环阈值(《 = 6，^ 土 d
样本
G 1
型
G 2
型
G 3型
G 4
型
四重q P C R
单重q P C R
四重q P C R
单重q P C R
四重q P C R
单重q P C R
四重q P C R
单重q P C R
G 1234-120. 70 士 0. 2820. 69 ± 0. 0422. 25 ±0.2123. 77 ± 0. 0922. 00 ± 0• 0023. 10 ±0.2920. 78 ± 0. 2720. 93 ± 0• 03G 1234-223. 66 ± 0. 0723. 85 ±0. 1625. 43 土 0. 0626. 93 ± 0. 0623. 24 ± 0. 1123. 66 ± 0. 6623. 79 ± 0. 0624.11 ±0.02G 1234-327. 03 ±0.2127. 14 ±(). 1528. 81 ±0.0429. 75 土 0. 1423. 32 ± 0. 0024. 00 土 0. 0027. 47 土 0• 3527. 54 ±0. 18G 1234-429. 96 ± 0. 0030. 38 士 0. 3932. 71 土 1.9732. 40 ±0. 0422. 22 ± 0. 00
23. 02 ±0. 18
30. 83 ± 0. 0030. 97 ± (). 06G 1234-5
33. 98 ±0.15
34. 15 ±0. 28
34. 09 ± 0• 06
35. 35 土 0. 04
--
20. 29 ± 0. 13
20. 95 ± 0• 08
t 值 2. 505 2. 892 4.851 2. 522P 值
>0.05
炸鸡排的做法>0• 05
>0. 05
>0. 05
注：q P C R ：实时定量PCR ;-：检测结果为阴性大学计划
5 0 5 0
4 3 3 2 20
5
03 2 2婴a :u d b _
塔蓝图拉毒蛛l l
l
国际生物制品学杂志2020年12月第43卷第6期Int J Bio丨ogicals, December 2020, Vol. 43, No. 6• 291 •
关性较好CR2 >〇.95)，检测结果之间的差异无统计 学意义(P>0.05)。
多重qPCR是在单次反应中同时扩增1个以上 耙标序列[12]，在处理较大量样本或混合感染样本时 具有绝对优势，但是反应体系复杂，对于引物/探针 和试剂的要求较高。本研究同时采用TaqMan®和 TaqMan® M G B探针，使多重q P C R成为可行。TaqMan® M GB探针与TaqMan®探针的原理基本
相同，不同的是前者采用非荧光淬灭基团标记，本身 不产生荧光，因此可大大降低本底信号的强度。同时探针上的MGB修饰基团可将探针的熔解温度提 高10 °C左右，增加了配对序列与非配对序列的差 异，从而使探针的杂交稳定性和特异性显著增强。
本研究所采用的样本均为型别和浓度已知的体 外转录R N A混合样本，因此试验的相关性较好。今后仍需对未知型别和浓度的单价或多价疫苗及病 毒样本进行检测，对病毒抽提过程中所涉及的病毒 回收率进行研究，以进一步验证方法的适用性。
One Step PrimeScript™RT-PCR Kit(Perfect Real Time)是普通的qPC R试剂盒，常用于单重qPCR的建立。相对于其他商业化多重qPCR预混 液，该试剂盒对多重qPCR反应体系优化效果一般。后期可以尝试采用商业化的多重qPCR预混液对所 建立的三重和四重qPCR进行优化，进一步提高方 法的灵敏度、重复性及适用性。
本研究对多重qPCR方法进行了探索，实现了 在同一反应管中同时对3种以上目的基因进行分型 和定量检测的目的，从而能缩短检测周期，降低检测 成本，为未来多价轮状病毒疫苗及混合病毒感染样 本的快速分型和定量检测方法的建立提供借鉴。
利益冲突所有作者均声明不存在利益冲突
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