夏天的图画
剑叶龙血树cDNA文库构建
农学院农学专业蒋细兵
摘要采用Logemann等人修改的方法提取剑叶龙血树幼叶总RNA，使用Oligotex mRNA Spin-Column Kit 分离mRNA，利用SMART TM cDNA Library Construction Kit
及MaxPlax TM Lambda Packaging Extracts体外包装，构建剑叶龙血树的cDNA文库．初
始文库与扩增文库滴数分别为5.75×105 pfu/ml和5.6×109 pfu/ml．此文库的构建将为
今后研究剑叶龙血树血竭形成的分子调节机理奠定基础。
关键词剑叶龙血树；血竭；体外包装；cDNA文库
Construction of cDNA Library of Dracaena cochinchinensis
Jiang Xibing
Abstract Total RNA was extracted from the leaves of Dracaena cochinchinensis (Lour.)S.C.Chen. Adopting Oligotex mRNA Spin-Column Kit to parate the mRNA; using the SMART TM cDNA Librar
y Construction Kit and the MaxPlax TM Lambda Packaging Extracts, we have constructed the objective library. The titer of primary library and amplified library is 5.75×105 pfu/ml and 5.6×109 pfu/ml, respectively. The work can be the foundation for the study on regulating mechanism of the formation of Dragon’s Blood in molecular level.
Key words Dracaena cochinchinensis(Lour.)S.C.Chen；Dragon’s Blood vitro；年休假条例
packaging；cDNA library
剑叶龙血树，Dracaena cochinchinensis(Lour.)S.C.Chen，属龙舌兰科龙血树属植
物，在我国主要分布于云南南部、广西南部和海南，已被列为我国第一批珍稀濒危
保护植物，属国家三级重点保护植物．剑叶龙血树受禾谷镰刀菌云南变种等真菌感
染后，能使其形成植物防卫素，产生红色树脂[5]．这种红色树脂就是我国传统的重要
南药——血竭（龙血竭），黄酮类物质是其主要成分，大量研究表明该类成分具有明
显的抗细菌、抗真菌、抗氧化、抑制血小板聚集、抗血栓和增强纤溶等活性[3]．现代
药理学研究表明，血竭能治疗各种血症、心血管疾病、溃疡、炎症，还有一定抗衰
老、抗肿瘤作用．然而剑叶龙血树生长缓慢，与血竭木需求量存在日趋严重的矛盾. 西
双版纳热带植物园科技工作者对血竭原料消耗调查表明，2001 年全国血竭木年市场消耗量已达601 吨．到2006 年将达1436 吨，随着血竭的利用范围日益广泛，血竭原料的市场需求还将相应增加．
鉴于血竭的主要成分为黄酮类物质，其生物合成受PAL、CHS、CHI等多个基因调控[8]，可以通过调控黄酮类物质的生物合成基因的表达提高血竭的产量.
构建剑叶龙血树cDNA文库将为相关基因筛选和其全长cDNA测序及其功能分析提供了基础.
1 材料与方法
1.1 材料
盆栽剑叶龙血树幼叶；分子生物实验室常用设备；Oligotex mRNA Spin-Column Kit(QIAGEN)、SMART TM cDNA Library Construction Kit (Clontech)、MaxPlax TM Lambda Packaging Extract (Cambio)；液氮；95%、85%乙醇；氯仿、苯酚、异戊醇；1M、10mM MgSO4；20%麦芽糖；15mg/ml四环素母液(溶于水)；IPTG(100mM)、X-Gal(100mM)；10×Lambda dilution buffer ( 终浓度：
NaCl /1.0M; MgSO4 /0.1M; Tris-HCl (pH 7.5) /0.35M )、1×Lambda dilution buffer；LB/tet (15μg/ml) plate，LB/tet (15μg/ml ) /MgSO4 (10mM) plate，LB/MgSO4(10mM) /Malto (0.2%) broth，LB/MgSO4顶层琼脂糖；DMSO等．
1.2 总RNA提取和mRNA分离
剪取1-2 g新鲜幼叶，经液氮处理后保存于-70 ℃冰箱中．用经氯仿和高压灭菌处理的研钵，在液氮中迅速研磨至粉状，采用Logemann等人修改的方法提取总RNA，并用分光光度计测其浓度与纯度，1.5%琼脂糖甲醛变性胶检测其完整性．取0.25 mg 总RNA按试剂盒(Oligotex mRNA Spin-Column Kit)的说明进行mRNA分离．
1.3 cDNA的合成及检测
按照SMART TM cDNA Library Construction Kit（Clontech）说明，取1 μl mRNA 合成cDNA第一链，加入1 μl 氢氧化钠后，在68℃下温育30 min，通过引物延伸PCR
℃ min．）．吸
十二英语怎么写℃ c，68 /8
合成ds cDNA （70 /10
℃ min；95 /1
℃ min；20个循环为95 /15
取5 μl样品用1.1%的Agaro/EB进行检测．
游故宫作文1.4 蛋白酶K消化和SfiⅠ酶切及片段过柱分离
通过蛋白酶K消化将引入的蛋白质降解并进行cDNA纯化，纯化后溶于79 μl ddH2O的cDNA经SfiⅠ酶切，为连接到载体准备接头．后过柱分离，按序滴入16个1.5
ml的离心管，1.1％ Agaro/EB检测，选取前5 管混合成一管，经沉淀后的cDNA 再溶于7 μl ddH2O．
1.5 λ TriplEx2载体连接与体外包装
cDNA与载体λ TriplEx2以1:1的比例混合，T4 DNA连接酶16 ℃水浴过夜．过夜产物加入25 μl包装液，30 ℃温浴90 min，后加入剩下的25 μl包装液，再30 ℃温浴90 min．加入500 μl稀释buffer（SM），加入25 μl氯仿，即建成初始文库．
1.6 寄主细菌的培养
在LB/tet板上划线E.coli XL 1-Blue，37 ℃封口倒置培养过夜（原始板），4 ℃保存；挑取原始板的单克隆在LB/MgSO4/tet板上划线，37 ℃倒置培养过夜（工作板）．用于滴数测定、文库扩增时，挑工作板上的单克隆于20 ml 的LB broth/MgSO4/malto 中37 ℃震荡培养过夜，培养过夜的菌液室温5000 rpm离心5 min沉淀菌体，使用10 mM MgSO4重悬浮，调节OD600值约为2.0．
1.7 顶层琼脂和平板准备
使用前融化4 ℃保存的顶层琼脂，44 ℃水浴保持液态．使用LB/MgSO4平板前（直径为90 mm），在37 ℃恒温箱中温育2-3 h．
1.8 原始文库滴数和重组率测定
按1/50、1/500、1/1000稀释文库，分别取10 μl、50 μl、50 μl稀释液加入到200 μl重悬浮于10 mM MgSO4的新鲜E.coli XL1-Blue菌液中，37 ℃水浴20 min．水浴产物转入事先加有50 μl X-Gal & 50 μl IPTG的3 ml液态顶层琼脂糖中，迅速混匀并倒入预热的平板中，左右前后倾斜使琼脂糖均匀地平铺于板上，避免产生气泡，静置10 min．待顶层琼脂糖变硬后，封口，37 ℃恒温倒置培养. 定期观察噬菌斑生长的情况，选最佳时期统计噬菌斑并计算相关值．
滴数计算公式：
噬菌斑数*稀释倍数*(1000 μl/ml)
倒顶层琼脂使用的稀释体积
1.9 文库扩增及滴数测定
取8个150 mm的培养皿用于扩增原始文库．吸取5 μl原始文库λ噬菌体转染500 μli XL 1-Blue菌液，用5 ml顶层琼脂糖倒顶层板，37 ℃扩增8小时．4℃放置数小时后，每板用12 ml 1×SM将λ噬菌体洗脱下来．将要长期保存的文库加入7%的DMSO，液氮处理后，保存于-70 ℃．
按10-5、10-6、10-7、10-8稀释比，各取100 μl稀释液转染200 μl菌液，测量滴数，
方法同上．
2 结果与分析
2.1 总RNA提取的结果
取 2 μl提取的总RNA用无菌水稀释至200 μl，测得浓度为 2.68 mg/ml，
OD260/OD280为1.87；取5 μl在1.5%的琼脂糖甲醛变性胶上跑
主食有哪些食物胶后，在胶上呈现两条明显亮条带(如右图)，28s片段亮度近
是18s片段的两倍，说明RNA浓度较高、纯度较好，符合cDNA
文库构建库的要求．
2.2 ds cDNA合成及片段分离结果
通过引物延伸PCR合成第一链，取5 μl样品跑1.1%的琼脂糖胶，从
图可见cDNA成弥散状分布于两指示剂之间(图1)；分别取3 μl 经SfiⅠ
酶切后过柱产物的16个样品（每个
约40 μl），用大电压(100 v)跑1.1%
的琼脂糖胶10 min检测表明，从第8
管开始出现亮斑(图2)．
2.3 体外包装及滴数测定
按1:1的比例连接载体，采用MaxPlax TM Lambd Packaging Extracts获得约600 μl 包装产物．稀释的λ噬菌体转染E.coli XL1-Blue，测得初始文库的滴数为5.75×105 pfu/ml，重组率为80.3%；扩增文库的滴数为5.6×109 pfu/ml．
3 结论和讨论
3.1 至此认为剑叶龙血树的cDNA文库构建成功。
3.2 RNA的纯度和完整性直接决定了文库的质量．在实验过程中必须带橡胶手套，使用的器皿尽可能去除RNA酶的影响，使用的枪头最好为-20 ℃保存的灭菌的枪头，使用的离心管必须为无RNA酶存在，以保证RNA的完整性．使用试剂盒分离mRNA，首先必须保证总RNA完整性，同时取适量总RNA也将影响分离的效果。儒林外史在线阅读
3.3 体外包装每一包装液是分两次分别加入的，而室温解冻后的包装液长时间在冰上放置同样会降低之后的包装效率，因此，在加完一半后迅速将剩下的一半液氮处理，-70 ℃保存至使用。
3.4 初始文库在加入氯仿时（有杀菌作用），由于包埋液成分主要为蛋白质，故剩余的蛋白质会产生白色絮状沉淀，可能与包埋效率有关，文库质量可通过滴数和重组
率测定确定．文库初始滴数低于试剂盒的1.0×106 pfu/ml要求，可能与连接比例并非最佳，以及与测定时采用加转染液到顶层琼脂中而菌体损失有关。
3.5 在倒板时，由于要加入MgSO4等其他物质，就得尽可能避免气泡的产生，加入时沿壁或伸入液体加入，同时吸液时防止自带气泡；同时可以先将MgSO4加入其中，再高压蒸汽灭菌。
3.6 测量滴数时，顶层琼脂糖可以用琼脂替代，但文库扩增时最好使用琼脂糖，因为琼脂粉可能引进某些抑制剂，而影响文库的质量. 顶层琼脂糖必须融化透，否则会因倒板不平而无法清点噬菌斑. 而倒
顶层板时温度高于45.0 ℃，将烫死部分菌体．3.7 测定文库滴数时，尽量采用高倍稀释比和大体积稀释液，以保证测定结果的准确.扩增文库的滴数取决于培养的时间，文库扩增培养时间要适当，到9-10的数量级即可，过高将增加筛库基数。
帅气的句子3.8 初始文库可4 ℃保存2周，若要放置更长时间，可分装后加7 % DMSO，液氮处理，-70 ℃保存；避免反复冻融．建议妥善保存初始文库，这将有利于目的全长cDNA 的筛选。
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致谢
本论文全部试验在中国科学院西双版纳热带植物园昆明分部基因资源与基因功能组完成。由衷感谢导师余迪求悉心指导和无私帮助，同时非常感谢组里老师和同学的多方面的帮助和照顾，使我能顺利完成本试验。
