姜昊颖1,3
，杨福孙1,2，宋希强1,2※
(1.海南大学热带作物种质资源保护与开发利用教育部重点
实验室，海南儋州571737;2.海南大学园艺园林农学院，海南儋州571737;
3.海南省珠峰林业生态研究所，海南海口571102)
摘要：由于人为的采挖和原生境的破坏，华石斛野生资源受到严重威胁。因此，保护华石斛野生资源及其生境，加
快野生植株的繁殖显得非常重要。该研究以华石斛种子为材料，分别于7月和9月，播种于不同的附生宿主树种(毛绵杜鹃，竹叶松，碎叶蒲桃，大叶布拉栎和大果马蹄荷)，并监测其种子萌发的状况。研究结果表明:(1)华石斛种子对附生树种有一定的选择性。人工播种的毛绵杜鹃上均有原球茎萌发，萌发率达到100%，平均每株树萌发14.71个原球茎。竹叶松和碎叶蒲桃上的原球茎数增加的差异不明显，对照大叶布拉栎和大果马蹄荷则没有原球茎萌发。(2)播种时间影响华石斛种子萌发与原球茎的形成。7月份播种的毛绵杜鹃和竹叶松，原球茎萌发数较多;9月份播种的碎叶蒲桃上萌发的原球茎远远高于毛绵杜鹃和竹叶松上，达到为4.5个/株。该实验结果暗示雨季可能是华石斛播种的最佳时期。此外，人工播种树上萌发的原球茎基本集中在华石斛植株上方30cm 至下方40cm 的范围内，这为今后播种位置的选择提供了依据。
关键词：华石斛；种子共生萌发；菌根真菌；宿主选择性
中图分类号:S 682.31文献标识码:
B j.is s n.1672-0938.2011.02.011
华石斛原生境条件下人工播种的初步探讨
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Preliminary Study on artificalsowing of Dendrobium sinen innatural habitat inBawangling NaturalRerve,HainanIsland
JiangHaoying 1,3,YangFusun 1,2,S ongXiqiang 1,2※
(1.KeyLaboratoryof ProtectionandDevelopmental Utilizationof Tropical CropGermplasmResources (HainanUniversity)),
Ministry of Education,Danzhou 571737,Hainan ,China;2.College of Horticulture,Hainan University,Danzhou 571737,Hainan ,China ;
3.Institute of Everest Forestry ecology,Haikou,571102Hainan ,China
)
Aim s The w ild populations of Dendrobium s inens e are under the threat of extinction due to over-collection and habitat des truction .Effective ex-s itu propag ation m ay help boosting the w ild populations.Our aim is to find the factorsw hich can prom ote ed g erm ination and production of s
ym biotic s eedling s w hhich also g uide for artificial cul-tivation,reintroduction and protect w ild resources.
Methods S eeds harvested from w ild plants of D.sinen in Baw ang ling natural rerve,w ere sow ed on the host trees as follow s,S yz yg ium buxifolium ,Rhododendron m oulm ainens e,P odocarpus neriifoliu,C yclobalanopsis blake and Exbucklandia tonkinens i at July and S eptem ber res pectively.The ed g erm ination and procedure of protocorm de-velopm ent w ere obs erved m othly.
Im portant finding s Germ ination rate of D.S inen varied from the hos t trees.100percentag e of s eed g erm ina-tion in Rhododendron m oulm ainen is investig ated w hile 57.14%and 33.33%in S yzyg iumbuxifoliumand Podocar-pus neriifoliu,but the control hos t trees w ith Cyclobalanops is blake and Exbucklandia tonkinensi s has no s eed g er-基金项目：海南省自然科学基金(310025)，海南省中药现代化专项资金(2011ZY013)
作者简介：姜昊颖(1983-)，女，山东乳山人，在读硕士，从事兰科植物种质资源研究。
通讯作者:*Author for corres pondence.E-ma il:s ong.s trong@
.com. All Rights Rerved.
兰科植物是典型的菌根植物，菌根真菌对于自然状态下兰科植物正常的完成生活史具有不可代替的作用。兰科植物种子微小，仅具有未分化的原胚，在自然条件下，种子萌发阶段必须部分或完全依靠菌根真菌为其提供营养才能生存(范黎,1998)。虽然无菌组培技术推动了兰科植物的繁育，但是仍有部分物种难以通过组培来繁殖。而共生萌发技术的应用，成功繁育了这些稀有和濒危物种(Clements ,1986;Muir ,1987)。通过原地共生萌发技术可以定量研究自然生境下兰科植物的萌发率和幼苗的死亡率，还有助于从原球茎和幼苗中分离到能促进种子萌发的合适真菌，并作为兰科植物重引入和潜在生境选择的重要依据，为维护或重建兰科植物种群提供可行的基础保障。石斛属植物是兰科附生植物，全世界约1500种，主要分布于热带、亚热带及大洋洲(宋经元,2004)。我国有77种2变种，分布于秦岭、淮河以南的各省区，集中分布于四川、云南、贵州、广东、广西、海南等省(吉占和,1999)。由于石斛属植物集药用和观赏于一体，目前主要靠野外采挖来满足市场需求，巨大的市场需求导致采挖过度，致使我国野生石斛资源遭到了严重破坏，有些地区甚至面临枯竭，对野生石斛资源的保存的研究刻不容缓。自然条件下，石斛属植物主要通过分蘖(营养繁殖)和种子(有性繁殖)两种方式进行繁衍。而
进行营养繁殖的分蘖枝一般只能延伸至根部周围10～20cm 的范围内，严重限制植株的向外扩展，不利于种群的发展。由于种子的特殊形态和种子萌发阶段对真菌的依赖，石斛属植物种子很难萌发成活，这也是导致石斛濒危的一个主要原因。
华石斛Dendrobium sinen 为石斛属多年生附生植物，是海南特有种，仅分布在海南中西部山区海拔1000m 以上的山地常绿林和高山矮林树干上，极具观赏价值和药用价值(杨福孙,2009)。华石斛自然萌发率低，繁殖能力弱，生长缓慢，由于生境受到严重破坏，野生华石斛资源处于濒临灭绝状态。该实验采用成熟华石斛种子涂抹在附生宿主乔木上，监测华石斛种子的萌发时间和生长状况，剖析附生树种、温湿环境因子、播种时间等与人工播种华石斛种子是否萌发的关系。通过原生境条件下的人工播种实验，以期找到影响自然条件下华石斛种子萌发的关键因子，为深入探讨了华石斛种子原地共生萌发技术提供了可能。
1材料和方法
1.1试验材料
该研究所用华石斛种子采集于海南省霸王岭自然保护区(109°05′～109°25′E ,18°50′～19°05′N )。当蒴果外果皮由绿转为黄色，果荚即将开裂时采集；取回实验室自然阴干至果荚开裂，取出种子保存于4℃无菌试管中备用。
华石斛人工播种地点位于海南省霸王岭国家级自然保护区3个华石斛野生居群内，海拔为1300m ～1380m 。选取华石斛附生偏好性树种碎叶蒲桃Syzygium buxifolium 和毛绵杜鹃Rhododendron moulmainen (杨福孙,2009)，附生较少树种竹叶松Podocarpus neriifoliu 以及无华石斛附生的大叶布拉栎Cyclobalanopsis blake 和大果马蹄荷Exbucklandia tonkinensi 树种为对照进行播种。
m ination ;Conract to the protocorm s form ation rate is 14.71per host plant of Rhododendron m oulm ainens e,S yzyg ium buxifoliumand Podocarpus neriifoliu has 2.71and 6.33procorm sin one host plant respectively.S eed g erm ination and protocorm s form ation have col relations hip to the sow ing period but varying from the hos t tree.,such as Rh.m oul-m ainens e and P .neriifoliu,has a hig hr protocorm s form ation rae in J uly.but on the other hand,the ca happen to the S .buxifolium in S em ptem ber w ith 4.5protcorm s in one host treet.The res ults indicated that rainy as on w ould be the bes t sow ing period for D.S inens e.Finally,the distance rang ed fromupside 30cm to dow nside 40cm aw ay from the w ild orchid individual in host trees on w hich protocorm s is inclined to be indouced,w hich als o s how that it is suitalbefor pos sible s ite for sow
含有近反义词的成语
ing
Dendrobium sinen ,sym biotic g erm ination ,orchid m ycorrhiazal fung i ,s pecific hos t tree Dendrobium sinen
.com. All Rights Rerved.
1.2实验方法1.
2.1播种时间分别于2008年7月和2008年9月，人工播种华石斛于原生境的宿主树皮上。每月观察种子萌发情况，并对萌发的原球茎进行统计。1.2.2播种方法成熟华石斛种子用无菌水配成种子液，将种子
液涂布于华石斛宿主树皮上。有华石斛植株的宿主上，在华石斛植株上下1m 范围之外的树皮上均匀涂播种子；无华石斛植株附生的宿主树皮上，以所处样地有华石斛植株附生的相同树种的播种高度为准均匀涂播2m 。种子涂布树皮后，采用无菌纱布进行覆盖，以不覆盖纱布为对照。1.2.3数据处理种子萌发后，用小皮尺测定萌发的原球茎与华石斛植株的距离(分植株上方与下方测定)，并统计各播种树华石斛种子萌发数；同时设50m ×50m 样方调查播种样地内同种附生宿主树种的数量及种子萌发原球茎数，计算出附生宿主单树原球茎萌发数及各附生宿主原球茎产生率。原球茎产生率(%)=萌发原球茎的树数/样方内同种附生树数(人工播种树以播种树数计)×100。SAS 9.0Duncan 新复极差法统计分析。2结果2.1种子萌发率与播种基质播种后2.5个月能观察到华石斛种子的萌发，人工播种的附生树上原球茎萌发数和萌发率均比未播种树有所增加(表1)：其中人工播种的毛绵杜鹃上均有原球茎萌发，萌发率达到100%，平均每株树萌发14.71个原球茎，与未播种的毛绵杜鹃上的原球茎差异显著，而竹叶松和碎叶蒲桃上的原球茎数增加的差异不明显，原球茎萌发率也高于未播种树；大叶布拉栎和大果马蹄荷没有华石斛原球茎萌发。调查各播种树所处50m ×50m 样方内相同树种上华石斛原球茎的萌发数发现，自然条件下，毛绵杜鹃和碎叶蒲桃单株树上萌发的原球茎平均为0.41和0.44个，稍高于竹叶松的0.2个。整体来看，毛绵杜鹃上原球茎的萌发数和萌发率与其他树种差异显著。华石斛种子萌发结果说明在不同附生树上播种华石斛种子，产生原球茎数和几率存在一定差异，且人工播种和自然萌发的结果稍有不同。
注：表中a b 表示经Dunca n ’s 新复极差方差分析分别达到显著与极显著的结果。下同。
Note :a b res pectively expres s s ignifica ntly res ult a nd very
s ignifica ntly res ult by Dunca n's new multiple ra nge a na lys is of
va ria nce.S a me a sbelow
2.2种子萌发率与播种时间
不同的播种时间对附生树上萌发的原球茎的影
响也不同(表2)。7月份播种的附生树上，毛绵杜鹃
和竹叶松上原球茎萌发数较多，平均每株树有32和11.67个，与未播种树相比差异极显著；而碎叶蒲桃则是未播种树上萌发的原球茎数多于播种树，但两者差异不显著。9月份播种碎叶蒲桃上萌发的原球茎为4.5个/株，高于毛绵杜鹃和竹叶松上的。播种时间的不同对毛绵杜鹃和竹叶松上原球茎的萌发率
自制航模没有影响，而碎叶蒲桃则是9月份播种原球茎萌产生率较高。三种树上原球茎萌发数率与未播种树的差异均不显著。大叶布拉栎和大果马蹄荷上均没有华石斛原球茎萌发。
表2播种时间对华石斛种子萌发的影响
高档女包
2.3种子萌发率与附生宿主的距离
人工播种树上萌发的原球茎基本集中在华石斛植株上方30cm 至下方40cm 的范围内，距离植株越远，萌发的原球茎数量越少(表3)。在毛绵杜鹃树上，华石斛植株上20～30cm 和植株下方0～20cm 处萌发的原球茎数最多，与附生树上其他范围内的萌发数差异极显著。碎叶蒲桃上则仅在植株上下各30cm 的范围内有原球茎萌发。竹叶松上华石斛植株上下0～40cm 的范围内均原球茎萌发，其中植株上方0～10cm 和植株下方30～40cm 处萌发的原球茎表1.播种不同附生树华石斛种子萌发的结果
Table1.Resultsof propagationontheedsgerminationofdifferentepiphytichosttrees
毛绵杜鹃碎叶蒲桃竹叶松大叶布拉栎大果马蹄荷原球茎数(个/株)原球茎萌发率(%)
附生树播种树未播种树播种树未播种树
14.71b 2.716.330.000.000.410.440.200.000.00100.00a 57.1433.330.000.0016.67
9.52
3.56
网吧收银员
0.00
0.00Table 2.Effect of propagation time on the eds germination of D.sinen
毛绵杜鹃碎叶蒲桃竹叶松大叶布拉栎大果马蹄荷原球茎数(个/株)原球茎萌发率(%)
附生树7月播种树未播种树
32.00b 0.3311.67a 0.000.000.250.300.250.000.00 5.564.170.000.000.0018.75
17.26
11.11
0.000.00
9月播种树未播种树7月播种树未播种树9月播种树未播种树3.001.330.000.000.00 1.754.501.000.000.00100.0033.3333.330.000.00100.0075.0033.330. All Rights Rerved.
较多，与附生树上其他范围内的萌发数差异也极显著。
表3华石斛萌发原球茎与植株的关系
2.4华石斛种子萌发动态
播种后2个半月后可观察到华石斛种子萌发；播种后4个半月后附生宿主树上华石斛萌发原球茎数达到高峰，在6个半月后华石斛种子萌发的原球茎数基本趋于稳定(表4)。未播种树上华石斛原球茎生长与消亡动态与播种树相似。
表4华石斛播种后萌发原球茎动态(个/株)
3讨论分析
近年来国内外学者对部分地生兰及腐生兰进行了共生萌发实验并取得了一系列的成果(徐锦堂等, 1989,2001)，然而对附生兰如何开展共生萌发实验还没有成熟的方法。兰科植物种子原地共生萌发技术是兰科植物保育及维持兰科植物正常居群常用的一项技术，种子装在特制的袋子中，埋于兰科植株原生境中，通过种子袋观察种子是否萌发，获得最早接触种子并促进种子萌发的有益真菌(Rasmusn et al.,1993)。
兰科真菌通常都是腐生菌，主要存在于土壤、枯枝落叶及生物残体内，也可能存在于附生兰的宿主上和空气中。因此，如何获得最有效的促进种子萌发的真菌，是真菌应用于兰科植物的种子繁殖的一个重要研究方向。
华石斛种子非常微小，不能为种子萌发提供充足的养分，需要由共生真菌给为其萌发提供养分。自然条件下，真菌与种子接触及侵染存在一定的时间差异，从而影响华石斛种子的萌发。每年的9～12月份华石斛种子不断萌发后，随着原生境温度及湿度的降低，刚萌发的华石斛原球茎会不断消亡；由于干旱的影响，一些华石斛附生树的树皮开裂甚至脱落，也严重影响了华石斛原球茎成苗的比例。华石斛自然萌发的原球茎数非常低，而人工播种后萌发的原球茎数明显增加，宿主树上萌发的原球茎的比例也有较大提高；在没有华石斛植株附生的树上(如大叶布拉栎和大果马蹄荷)没有观察到有原球茎产生，是因为该树上没有适合的共生真菌还是树皮的理化性质对种子的萌发有抑制作用，还需要进一步的研究。
自然状态下每年1～2月份附生树上华石斛萌发原球茎数量最高，至5～6份华石斛原球茎数基本稳定并逐渐成苗。该实验结果表明雨季是华石斛播种的最佳时期
兰科植物种子萌发需要共生真菌提供养分，萌发后共生的真菌还能促进植株的生长，因此在其植株周围可能存在促进种子萌发的真菌，附生树的树皮就是这些真菌的培养基，菌丝将种子与附生宿主树皮
相联系起来，传递水分及养分等物质，使种子能正常萌发。华石斛种子萌发结果表明，华石斛植株周围有能促进种子萌发的真菌存在，而树皮上的其他附生植物如苔藓、地衣、蕨类植物等对真菌的分布也有一定的影响。
随着研究的深入，如何筛选出促进华石斛种子萌发的真菌，并利用真菌与种子共生播种，在原生境条件下促进种子萌发，提高种子萌发率及成苗率等问题将逐步得到解决，可为兰科植物尤其是附生兰的保育提供更多技术帮助。
参考文献
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the S ymbiotic Germina tion of Europea n Terres tria l
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Orchid Rev,1987,95:27～29
[3]范黎，郭顺星.兰科植物菌根真菌的研究进展.微生物学通
报,1998,25(4):227～230
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究.菌物系统,2001,20(1):137～141
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—紫其小菇.真菌学报,1989,8(3):221～226
[7]杨福孙.濒危兰科植物华石斛基于内生菌根真菌的保育生
物学.海南：海南大学博士学位论文,2009
碎叶蒲桃竹叶松
0.00
0.00
0.00
0.67
0.33
0.50
0.00
1.33
1.33
2.67
1.67
1.00
0.67
1.33
0.00
0.50
0.33
2.67
海口台风0.00
0.50
Table4.Change of germinating protocorms after propagation of D.sinen
毛绵杜鹃碎叶蒲桃竹叶松
大叶布拉栎大果马蹄荷播种树原球茎未播种树原球茎
附生树
75d135d185d75d135d185d
1.75 4.50 1.00 0.00 0.00
2.00
1.25
0.67
0.00
0.00
10.25
0.30
0.25
0.00
0.00
0.19
0.30
0.25
0.00
0.00 3.25
5.00
1.67
0.00
0.000
0.38
0.41
2013年清明节是几月几日0.40
0.00
0.00
Table3.Relationship between germinate protocorm of D.sinen and plant .com. All Rights Rerved.
