形容山的诗句如何拯救你那些被污染的细胞
燕几 污染是细胞培养的⼤敌。预防和避免污染是细胞培养成功的关键之⼀。⼀开始就要⼗分重视，防⽌污染，否则会前功尽弃，不仅浪费时间，⽽且浪费⼈⼒、物⼒，甚⾄造成⽆法弥补的损失。
(⼀)污染的类型
细胞培养过程中的污染不仅仅指微⽣物，⽽且还包括所有混⼊培养环境中的、对细胞⽣存有害或造成细胞不纯的物质，包括⽣物和化学物质。
1、细菌污染男的摸女的胸
细菌污染是实验室细胞培养中常见的污染，即使在细胞培养液中加⼊了抗菌素，也可能因为操作不慎⽽引起污染。最常见的有⾰兰⽒阳性菌，如枯草杆菌以及⼤肠杆菌、假单胞菌等⾰兰⽒阴性菌，其中⼜以⽩⾊葡萄球菌较常见。
培养细胞受细菌污染后，会出现培养液变混浊，pH改变。污染后细胞发⽣病理改变，胞内颗粒增多、增粗，最后变圆脱落死亡。
2、真菌污染
真菌污染是细胞培养过程中最常见的⼀种，最常见的真菌有烟曲霉、⿊曲菌、孔⼦霉、⽑霉菌、⽩⾊念珠菌和酵母菌。
李龙大 培养细胞受真菌污染后，可见培养液中漂浮着⽩⾊或浅黄⾊的⼩点，有的散在⽣长，培养液⼀般不发⽣混浊；倒置显微镜下可见丝状、管状或树枝状的菌丝纵横交错在细胞之间或培养基中，有的呈链状排列。
真菌污染后，细胞⽣长变慢，但最后由于营养耗尽及毒性作⽤⽽使细胞脱落死亡。
丝状菌污染
3、⽀原体污染
⽀原体是介于细菌与病毒之间能独⽴⽣活的最⼩微⽣物，最⼩直径0.2µm，⼀般过滤除菌⽆法去除它，光镜下难以看清它的形态结构。开始不易发现，能在偏碱条件下⽣存，对青霉素有抗药性。多吸附于细胞表⾯或散在于细胞之间。
培养细胞受⽀原体污染后，部分敏感细胞可见细胞⽣长增殖变慢，部分细胞变圆，从瓶壁脱落。但多数细胞污染后⽆明显变化，或略有变化，若不及时处理，还会产⽣交叉污染。
阳性
阴性
4、病毒污染
组织细胞培养过程中，如果没有除去潜在的病毒，就会产⽣病毒污染。⽬前，从原代猴肾细胞的培养中已发现不少于20种⾎清性病毒。
尽管病毒污染的细胞不影响原代培养，但⽣产疫苗是不安全的。因此，潜在病毒是细胞⼤量⽣产和疫苗、⼲扰素等⽣物制品制作中的难题。
5、⾮同种细胞污染
哥斯拉不说话 由于细胞培养操作时各细胞株所需的器材和溶液没有严格分开，往往会使⼀种细胞被另⼀种细胞污染。⽬前，世界上已有⼏⼗种细胞都被HeLa细胞所污染，致使许多实验宣告⽆效。
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⾮细胞培养物所造成的化学成分的污染也偶有发⽣，⼤多是由于细胞培养所需物品清洗消毒不彻底⽽带⼊⼀些有毒化学物质所致。
(⼆)污染的鉴别
1、细菌、真菌污染的检测
(1)⾁眼观察
细菌、真菌污染常在传代、换液、加样等开放性操作之后发⽣，⽽且增⽣迅速，若有污染，在48⼩时内可明显观察到，例如培养液变混浊，或略加振荡有很多漂浮物漂起。
(2)接种观察
采⽤普通⾁汤接种或⽤未加双抗药物的培养液接种，也可发现是否有污染。
(3)镜下观察
在倒置显微镜的⾼倍镜下可见培养液中有⼤量圆球状颗粒漂浮，即为细菌污染。
若细胞之间有丝状、管状、树枝状或卵形的物质常为真菌污染。
2、⽀原体污染的检测
(1)相差显微镜观察
直接取少许培养液滴在载物⽚上，再盖上盖⽚观察，⽀原体在镜下呈暗⾊微⼩颗粒，多位于细胞与细胞之间，有时可见类似于布朗运动的表现。应注意与细胞破碎溢出的内容物如线粒体等相区别。
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xxxx电影网 (2)荧光染⾊法观察
⽤荧光染料Hoechst33258，此染料能与DNA特异地结合，可使⽀原体内的DNA着⾊，荧光显微镜下⽀原体呈绿⾊⼩点，散在于细胞周围或附于细胞表⾯。
(3)电镜检测
若条件许可，可⽤扫描电镜或透射电镜观察。⼀般在细胞培养48～72⼩时，细胞接近汇合前，⽤胰酶消化细胞制成细胞悬液后进⾏固定、包埋、切⽚后才能进⾏观察。
⽀原体扫描电镜图⽚
(4)培养检测
将细胞悬液5mL加⼊45mL⽀原体⾁汤培养基，培养14天后观察⾁汤培养有⽆雾状沉淀，然
后取0.5ml加⼊已冷却到50℃的培养基中，再⽤琼脂培养基做分离培养，37℃培养3天观察有
⽆“荷包蛋”菌落出现。
3 、病毒的检测
1) 应⽤电镜技术快速诊断动物病毒病
冠状病毒电镜图
2) 逆转录_聚合酶链反应RT_PCR检测病毒
(三)污染的清除
培养细胞⼀经污染，多数较难处理。如果污染细胞价值不⼤，宜弃之；在寻找原因后彻底消毒操作室，复苏或重新购置细胞，再培养。
若污染细胞价值较⼤，⼜难于重新得到，可采取以下办法清除。
⼀、细菌和真菌的清除
1、使⽤抗⽣素
抗⽣素对杀灭细菌较有效。联合⽤药⽐单独⽤药效果好。预防⽤药⽐污染后再⽤药效果好。预防⽤药⼀般⽤双抗⽣素，污染后清除⽤药需采⽤⼤于常⽤量5～10倍的冲洗法，于加药后作⽤24～48⼩时，再换常规培养液。此法在污染早期有效。
⼆、⽀原体的清除
1、⽤MRA处理
⽤MRA(Mycoplasma Removal Agent)处理细胞，每4天换⼀次液，连续处理15天以确保细胞纯洁健康，效果好.
2、⽤清洗纯化法清除⽀原体污染的⽅法
细胞营养驯化→优质细胞群的筛选→细胞清洗→反复离⼼洗涤
其原理是利⽤离⼼⼒、细胞、微⽣物质量和悬液的浮⼒差达到清除⽀原体的⽬的。由于⽀原体个体⼩且除发酵⽀原体外多为细胞外寄⽣，所以通过反复洗涤细胞和低速离⼼换液使其中潜在的⽀原体数量降低⾄极限。
如结合敏感抗⽣素的抑杀作⽤，可达到更好的效果。
3、药物辅助加温处理
先⽤药物处理后，再将污染的组织培养物放在41℃培养18⼩时，可杀死⽀原体，但对细胞有不良影响。
4、使⽤⽀原体特异性⾎清
⽤5%的兔⽀原体免疫⾎清可去除⽀原体污染，因特异抗体可抑制⽀原体⽣长，故经抗⾎清处理后11天即转为阴性，并且5个⽉后仍为阴性。但此法⽐较⿇烦，不如⽤抗⽣素⽅便、经济。
(四)、污染的预防
预防是防⽌细胞培养过程中发⽣污染的最好办法。只有预防⼯作做在前，才能将发⽣污染的可能性降到最⼩程度。
⼀般预防可从以下⼏⽅⾯着⼿：
1、添加抗⽣素
2、从物品、⽤品消毒灭菌着⼿
细胞培养所⽤物品清洗、消毒要彻底，各种溶液灭菌除菌要仔细，并在⽆菌试验阴性后才能使⽤。
操作室及剩余的⽆菌器材要定期清洁消毒灭菌。
3、从操作者做起
(1)进⽆菌室前要⽤肥皂洗⼿，按规定穿隔离⾐。⼯作开始要先⽤75%酒精棉球擦⼿、擦瓶⼝和烧灼瓶⼝。
(2)操作者动作要轻，必须在⽕焰周围⽆菌区内打开瓶⼝，并将瓶⼝转动烧灼。操作时尽量不要谈话，若打喷嚏或咳嗽应转向背⾯。
(3)操作时要常更换吸管，⼀旦发现吸管⼝接触了⼿和其他污染物品应弃去。实验完毕⽤消毒⽔浸泡的纱布擦台⾯。
4、防⽌细胞交叉污染
在进⾏多种细胞培养操作时，所⽤器具要严格区分。
在进⾏换液或传代操作时，注射器和滴管不要触及细胞培养瓶瓶⼝，以免把细胞带到培养液中污染其他细胞。
细胞⼀旦购置或从别处引⼊，均应及早留种冻存，⼀旦发⽣污染可重新复苏培养。
5、⽆菌室的彻底消毒
1) 0.1%新洁尔灭全⾯彻底擦洗⽆菌室;
2)甲醛熏蒸法：甲醛是⼀种⼴谱灭菌剂菌，其⽔溶液和⽓休对各种细菌、芽孢及真菌等微⽣物均有杀灭作⽤。
