文章编号：1005-3832（2010）02-0011-05
收稿日期：2010-04-18
资助项目：现代农业产业技术体系建设专项资金资助（nycytx-49-10）；农业公益性行业专项（200803013）；黑水研基本科研业务费专项资金
（2008HSYZX-YZ-03）.殷武
作者简介：王荻（1980-），女，助理研究员，硕士，从事鱼类病害研究.
通讯作者：卢彤岩，研究员，主要从事鱼类病害研究.Email:
我爱发明全集东北三省9株嗜水气单胞菌
16S rDNA 序列比较研究
王荻，李绍戊，刘红柏，尹家胜，卢彤岩
（中国水产科学研究院黑龙江水产研究所，黑龙江哈尔滨150070）
摘要：采用特异性引物对采自黑龙江、吉林及辽宁省的9个嗜水气单胞菌分离株的保守基因16S rDNA 部分序列进行PCR 特异性扩增，对所得686bp 扩增产物进行测序并比较研究。序列分析显示，东北三省的9个分离株同源性极高，都在百分之九十以上，测得基因序列共有保守位点613个，变异位点73个，简约信息位点3个。辽宁省与吉林省分离株遗传距离为0.005049；辽宁省与黑龙江省为0.005049；而吉林省与黑龙江省为0.004232。以致伤弧菌为外群的M P 及NJ 聚类树聚类结果一致，黑龙江省的第一和第二分离株聚成一个分支，而其他各分离株聚成另外一个大的分支，其中辽宁省的第二分离株与吉林省的第一和第二分离株又聚为一个较小的分支。
实验结果表明，9个分离株相应保守区16S rDNA 片段变化较小，同源性极高，聚类不明显，没有形成明显的区域性或特异性的变化。
关键词：嗜水气单胞菌；16S rDNA ；黑龙江；吉林；辽宁中图分类号：S917.1,Q36
文献标识码：A
Comparison Study on 16S rDNA of Nine Aeromonas hydrophila Isolated from Northeast Provinces
WANG Di,LI Shao-wu,LIU Hong-bai,YIN Jia-sheng,LU Tong-yan
（Heilongjiang River Fisheries Rearch Institute,Chine Academy of Fishery sciences,Harbin 150
070,China ）
Abstract:A part of 16S rDNA fragments was amplified using specific primers to detect nine Aeromonas hydrophila strains isolated from Heilongjiang Province,Jilin Province and Liaoning Province.As a result,686bp sizes of fragments were quenced and analyzed between nine Aeromonas hydrophila strains.Sequence alignments showed that the nine isolates from three provinces were highly homologous with more than 90%similarity.Among of the obtained quences,there existed 613conrvative sites,73variable sites and 3parsimony informative sites.The genetic distance calculated by MEGA software indicated that genetic distance was 0.005049between the isolates from Liaoning and Jilin Provinces,0.005049between Liaoning and Heilongjiang Provinces,and 0.004232between Jilin and Heilongjiang Provinces.Cluster analysis also showed that the results were basically consistent with the outside group of Vibro vulnificus using two methods of maximum-parsimony （MP
）and Neighbor-joined （NJ ）.The results suggested that the first isolate and the cond isolate from Heilongjiang Province clustered together,while the other isolates were clustered to a large branch.Additionally,the cond isolate from Liaoning Province and the two isolates from Jilin Province clustered to a smaller branch.To sum up,there was a little difference among the conrvativ
e sites of 16S rDNA from nine isolates with highly homology.Cluster analysis further confirmed that no regional or specific changes formed among the nine isolates from three provinces.Key words:Aeromonas hydrophila ;16S rDNA;Heilongjiang Province;Jilin Province;Liaoning Province
Vol.23，No.2Jun.2010
第23卷第2期2010年6月
水产学杂志CHINESE JOURNAL FISHERIES
嗜水气单胞菌（Aeromonas hydrophila），隶属于弧菌科（Vibronaceae）气单胞菌属（Aeromonas），是一种广泛存在于水环境中的常见病原菌。它可单独或与其他致病菌一起协同感染，不仅能够引发多种水生动物的传染病，而且还能导致爬行类、两栖类、鸟类以及哺乳类等多种动物全身性败血症或局部感染甚至死亡[1]。同时，它也可引发人类的食物中毒、腹泻、败血症以及局部的伤口感染等病症[5-7]，影响食品安全，并且是免疫抑制病病人和肝功能疾病患者的机会致病菌。因此，其公共卫生学意义日益受到重视。自20世纪90年代以来，已有报道表明，嗜水气单胞菌作为水产养殖动物的主要细菌病致病菌之一，常引起我国淡水养殖鱼类的爆发性败血症，造成重大的经济损失[2-4]。
传统的细菌分离、鉴定要结合微生物涂板培养及多个生化管鉴定方法、血清型方法[8,9]才能确定其种类，费时、费力且敏感性不高，后期关于嗜水气单胞菌单克隆抗体检测的方法[10-13]较多，但是也较费时费力。近些年，随着分子生物学的发展及人们对嗜水气单胞菌研究的日渐深入，特异性PCR鉴定方法的应用也日渐成熟，扩增嗜水气单胞菌保守基因16S rDNA成为快速高效鉴定嗜水气单胞菌[14]的方法。
本研究对黑龙江，吉林和辽宁三省几个大型淡水鱼养殖场的嗜水气单胞菌进行分离，并对其9株分离菌株的16S rDNA基因部分序列进行克隆测序，以期确定采用16S rDNA序列扩增方法对东北三省嗜水气单胞菌进行快速检测、鉴定的可行性，并分析东北三省嗜水气单胞菌该基因之间的进化关系及同源性比对。
1材料与方法
1.1材料
表1嗜水气单胞菌分离株来源
Tab.1The sources of nine Aeromonas hydrophila isolates
嗜水气单胞菌参考株购自中科院微生物所；于黑龙江、吉林、辽宁三省8个淡水鱼养殖渔场采集患病
鱼及水样中的9个分离株进行检测分析，分离株来源地的其详细信息如表1所示：
党员自我剖析参考株及分离株的嗜水气单胞菌16S rDNA基因的特异性扩增引物设计参考储卫华，陆承平等人所设计引物[15]。由上海生工生物工程技术服务有限公司合成，其具体序列如下：
上游引物
P1：5’-GAAAGGTTGATGCCTAATACGTA-3’
下游引物
P2：5’-CGTGCTGGCAACAAAGGACAG-3’1.2方法
采用特异性引物对嗜水气单胞菌分离株的保守基因16S rDNA部分序列进行PCR特异性扩增。
经试验摸索，最终优化PCR扩增反应体系（25μL）如表2所示。适宜的PCR反应条件为94℃预变性10min；然后94℃变性30s，60℃退火30s，72℃延伸45s，循环30次；并于72℃延伸10min。PCR产物经1%琼脂糖凝胶电泳检测，电压6V/cm，电泳20分钟，保存图片用于查看分析。
表2PCR反应体系
Tab.2The reaction system of the PCR
采用UNIQ-10柱式PCR产物纯化试剂盒纯化PCR产物。将纯化产物与pMD18-T载体连接，转化入DH5α感受态细胞，阳性克隆检测后，经ABI PRISM3730XL测序仪测得克隆的9个嗜水气单胞菌分离株的16S rDNA部分序列（上海生物工程技术服务有限公司）。将所得序列数据整理并采用序列比对及进化树分析生物软件进行分析。
2实验结果及数据分析
2.1扩增反应结果
以购自中科院微生物所的嗜水气单胞菌参考株（BK）和9个分离株（H1、H2、H3、J1、J2、J3、L1、L2、L3）的单菌落作为PCR反应模板进行扩增，PCR
编号BK H1 H2 H3 J1 J2 J3 L1 L2 L3
来源鱼场
参考株（购自中科院微生物所，编号：C230801180）
黑龙江三合鱼场
黑龙江大庆丰池镜鲤
黑龙江万宝鱼场
吉林九台市水产良种场
吉林松原富达村
梅河口市共安水产良种场
辽宁省淡水水产科学研究成果推广中心
沈阳市辽中黄旗堡
辽宁省淡水水产科学研究成果推广中心
缓冲液Buffer（10×）
M gCl2
dNTP M ix
引物P1（20mM）
引物P2（20mM）
Taq DNA聚合酶
超纯水
2.5μL
1μL
1μL
1μL
1μL
0.2μL
18.3μL
水产学杂志第23卷
·12·
2期
王荻等：东北三省9株嗜水气单胞菌16S rDNA 序列比较研究
·13·
图2序列比对结果
Fig.2The results of quences alignments
H1H2H3J 1J 2J 3L1L2L3
V.vulnificus
H1H2H3J 1J 2J 3L1L2L3
V.vulnificus
H1H2H3J 1J 2J 3L1L2L3
V.vulnificus
H1H2H3J 1J 2J 3L1L2L3
V.vulnificus H1H2H3J 1J 2J 3L1L2L3
V.vulnificus
H1H2H3J 1J 2J 3L1L2L3
恶恶
V.vulnificus
H1H2H3J 1J 2J 3L1L2L3
V.vulnificus
610
620630640650660670680
510
520530540550560570580590600
410420430440450460470480490500
310
320330340350360370
380390400
210
220230240250260270280290300
110
120
130140150160170180190200
10
阿姨的英语怎么说20
30
40
50
60
70
80
90
100
TCGC
A C G
C
G
G
A A
A
A
T GT TCT T
C C
T
C
C
A A
A G A A T T C A G C
AGT
TCTGG
G
G
TA
T A A
G
T
T T
A A A
A T AC A
A T G
C
C CAGAG
C
T T T T T T T
A A A A A A A A
扩增产物经琼脂糖凝胶电泳，结果如图1所示：
图1PCR产物琼脂糖凝胶电泳图谱
Fig.1The electrophotogram of the PCR amplified products 图1中第一泳道为DNA分子量标准DL2000，而第二到第十一泳道分别为参考株及九个分离株
扩增产物。由图可见，分离株与参考株一样，均在目的条带686bp处呈现阳性扩增，且条带单一，亮度较好，说明反应模板得到了较好的扩增，其产物可以用于后续连接、转化、测序，并进行测序结果的分析。
2.2测序结果分析
经过生物公司测序，根据所得到686bp的测序结果，以致伤弧菌（V.Vulinifucus）相应的16S rDNA 基因部分序列为外群，经M uscle软件进行序列比对（见图2）。
序列比对结果显示，该段基因序列共有保守位点613个，变异位点73个，简约信息位点3个。各序列同源性较高，均在百分之九十以上，但是在118bp，215bp处H3，J3，L1和L3分别出现了一致性的腺嘌呤（T）替换胞嘧啶（C），鸟嘌呤（A）替换尿嘧啶（G）的碱基变换。而在374bp和660bp处，H1和H2也出现了碱基变换。
经软件M EGA计算三个省份嗜水气单胞菌测得序列的遗传距离，辽宁省与吉林省为0.005049；辽宁省与黑龙江省为0.005049；而吉林省与黑龙江省为0.004232。比较可见，吉林省与黑龙江省嗜水气单胞
菌16S rDNA的测序部分序列遗传距离较小，同源性较高，略高于辽宁省与黑龙江省和辽宁省与吉林省分离菌株的同源性。
2.3MP及NJ聚类树
将测序结果输入软件PUAP绘得MP及NJ聚类树如下图所示：
图3MP聚类树
Fig.3The polytree using Maximum-Parsimony method
图4NJ聚类树
Fig.4The polytree using Neighbor-Joining method
由图3及图4所见，经两种比对方法所得的东北三省9个分离株序列的聚类方式基本相同，以致伤弧菌为外群的有根聚类树中，黑龙江省分离到的第一和第二株聚成一个分支，而其他各分离株聚成另外一个大的分支，其中辽宁的第二株与吉林的第一和第二株又聚为一个较小的分支。
3讨论
黑龙江、吉林和辽宁三省地处我国东北地区，气候及水文条件虽有所差别，但并不显著。因此，水质环境及天然养殖条件比较相近。这种情况也间接的导致，东北三省养殖水体中细菌、真菌等微生物种类及特性相似。嗜水气单胞菌作为一种广泛存在于水环境中的细菌，在三个省份的天然及养殖水体中都有广泛分布，通过本研究结果也可以看出，采自三个省的9个分离株相应保守区16S rDNA片段变化较小，同源性极高，聚类不明显，没有形成明显的区域性或特异性的变化，仍保持着高度一致的遗传及生理特性。无论是采样的不同渔场、不同种类的鱼、不同的分离组织、还是不同的采样省份分离到的嗜水气单胞菌菌株都未表现出一定的独立性分支以及与其他分离株之间较大的遗传距离，为我们进一步全面研究提供了前提基础。
黑龙江省、吉林省和辽宁省均有大面积淡水鱼养殖。但是，在养殖模式、投喂方式、水源选取及机械化程度等方面有较大差异。黑龙江少吉林省多是大水面粗放型养殖，养殖密度小，池塘深度浅，人工用药少，自制饲料较多。而辽宁省的养殖模式趋于机械化，规模化，养殖密度大，人为监控较多。因此，分离到的嗜水气单胞菌序列聚类时，黑龙江省及吉林省的分离株遗传距离较小，而辽宁分离株与另外两省的遗传距离较远，可能与养殖模式及人为调控
BK H1H2H3J1J2J3L1L2L3 2000bp
注射用盐酸万古霉素1000bp 750bp 500bp0 250bp 100bp
-
--目的片段
16SrDNA（686bp）
H1H2
L2
J1
L3
L1
L2
女职工劳动保护
H3
J3
V.vulnificus
H1
H2
H3
L3
J3
L1
J1L2
J2
V.vulnflcus
水产学杂志第23卷
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2期王荻等：东北三省9株嗜水气单胞菌16S rDNA序列比较研究·15·
对水体环境及细菌的自身特性变化有关。
9个嗜水气单胞菌分离株序列在其16S rDNA 片段的高度保守，再次保证了至少在东北三省范围内采用此种特异性PCR扩增方法对嗜水气单胞菌快速检测的可靠及有效性。由于该方法的短时、节能、高效等优点，必将为今后嗜水气单胞菌的鉴定及分离工作作出一定贡献。
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