幼儿园小班区域活动观察记录表
臭氧和紫外降解面粉中的DON 及对面粉品质的影响
余以刚，马涵若，侯芮，唐语谦，肖性龙
（华南理工大学轻工与食品学院，广东广州 510640）
摘要：为降低面粉DON 含量，用臭氧及紫外线处理受污染的面粉，研究处理条件对降解效果的影响，对比处理前后面粉的蛋白含量、湿面筋含量和白度值并通过MTT 法评价降解产物安全性。研究表明，在臭氧浓度45.00 mg/L ，水分含量为16.00%的条件下处理DON 污染面粉60 min ，初始DON 含量为2.35、2.84、4.09和4.95 mg/kg 的面粉DON 降解率分别为46.59%、40.71%、38.96%和35.40%；在紫外照射强度1200 μW/cm 2，水分含量12.00%的条件下处理DON 污染面粉60 min ，相同初始含量的DON 降解率为39.89%、40.32%、36.68%和30.32%。两种处理后面粉蛋白质含量、湿面筋含量和白度等理化指标均无显著变化（p >0.05）。MTT 实验表明：DON 对LO2有很强的细胞毒性，给药48h 后细胞活性降低62.02%，相同DON 浓度的紫外降解产物使细胞活性降低17.50%，臭氧降解产物则使细胞活性仅下降2%（p >0.05）。本研究使用的方法可在短时间内有效降低面粉中DON 含量，对面粉品质无显著影响，两种方法的降解产物对LO2细胞毒性均显著下降（p <0.01）。
关键词：面粉；脱氧雪腐镰刀菌烯醇；臭氧降解；紫外降解；细胞毒性
文章篇号：1673-9078(2016)9-196-202 DOI: 10.13982/j.mfst.1673-9078.2016.9.029
Degradation of Deoxynivalenol in Flour by Ozone and Ultraviolet Light
and their Effects on Flour Quality
YU Yi-gang, MA Han-ruo, HOU Rui, TANG Yu-qian, XIAO Xing-long
(College of Light Industry and Food Sciences, South China University of Technology, Guangzhou 510640, China)
Abstract: In order to decrea the deoxynivalenol (DON) content of flour, contaminated flour samples were treated by ozone and ultraviolet (UV) light and the effect of the treatment conditions on DON degradation was studied; the protein content, wet gluten content, and whiteness of flour before and after treatment were compared. Additionally, 3-(4,5-dimethylthiazol-2-yl)-2,5-diphenyltetrazolium bromide (MTT) assay was employed to study the cytotoxicity of DON and the degradation products in LO2 cell line. The results showed that when the DON-contaminated flour was treated with 45 mg/L
ozone and 16.00% (m /m ) moisture for 60 min at room temperature, the DON degradation rates for the flour samples with initial DON contents of 2.35, 2.84, 4.09, and 4.95 mg/kg reached 46.59%, 40.71%, 38.96%, and 35.40%, respectively. When the DON-contaminated flour was treated with 1200 μW/cm 2 UV and 12.00% (m /m ) moisture for 60 min, the DON degradation rates of the above same flour samples reached 39.89%, 40.32%, 36.68%, and 30.32%, respectively. After the two treatments, the protein content, wet gluten content, and whiteness of flour showed no significant difference as compared to tho of control group. The results of MTT assay indicated that DON exhibited a strong cytotoxicity on LO2 cells, and the cell viability was reduced by 62.02% after 48 h of DON treatment. The products of UV and ozone degradation with the same initial DON concentration reduced the cell viability by 17.50% (p <0.05) and only 2% (p >0.05), respectively. DON in the flour could be degraded effectively in a short time using the method described in this study, which showed no significant impact on the flour quality. The degradation products of both the methods exhibited a significantly reduced cytotoxicity to LO2 cells.
Key words: flour; deoxynivalenol; ozone degradation; photodegradation; cytotoxicity
脱氧雪腐镰刀菌烯醇（Deoxynivalenol ，DON ）是一种单端孢霉烯族化合物，主要由小麦赤霉病病原
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收稿日期：2015-08-25
基金项目：粮食公益性科研专项经费项目（201313005）；广东省科技计划项目（2013B020311007）；国家自然科学基金面上资助项目(31271867) 作者简介：余以刚（1968-），男，教授，研究方向：食品安全与检测 通讯作者：肖性龙（1977-），男，高级工程师，研究方向：食品安全与检测
菌禾谷镰刀菌产生。DON 对谷物的污染率和污染水平
居镰刀菌毒素之首，每年有大量的粮食因被DON 污染而不能食用，人畜摄入了被DON 污染的食物会出现厌食、呕吐、白细胞下降和内脏出血等中毒症状[1]。1998年国际癌症研究机构（IARC ）将DON 列为第三类致癌物[2]。世界卫生组织（WHO ）将真菌毒素列为食源性疾病的重要根源，许多国家均规定了食品及饲
霜草苍苍虫切切
料中真菌毒素的限量以保护消费者健康，我国国家标准规定的食品中DON 最大允许量为1 mg/kg [3~4]。2001年美国FDA 有批准臭氧作为抑菌剂可以直接应用于食品工业，臭氧本身有特殊臭味且化学性质不稳定，
在常温常压下会自行分解成氧气，所以几乎不会造成
伤害[5~7]。
活动方案设计国内外学者用臭氧降解农作物中的真菌毒素做过许多研究，处理的农作物包括小麦籽粒、辣椒、玉米、花生、开心果和无花果干等，研究的主要真菌
毒素为黄曲霉毒素[6,8~11]。
近年来紫外照射技术以其二次污染小、对降解体系影响小等优点广泛应用于食品及环境中有害光敏物质的降解和去除，但是在降解谷物中真菌毒素方面的研究还不多[12]。
已有研究表明DON 对人外周血淋巴细胞、胃癌细胞、支气管上皮细胞和结肠腺癌细胞均有很强的细胞毒性，在人体内可能有一定的蓄积但无特殊靶器官[13~15]
。本文采用噻唑蓝比色法（简称MTT 法）研究DON 及其臭氧和紫外降解产物对体外培养的人正常肝细胞（LO2）细胞活性的影响以评价其降解产物的安全性。本文拟研究臭氧和紫外降解面粉中DON 的效果，分析处理前后面粉基本理化值，并通过人体正常肝细胞（LO2）的MTT 实验研究DON 降解产物的安全性。
1 材料与方法 1.1 原料与试剂
四种不同DON 含量的面粉样品（编号为1#、2#、3#和4#），受赠于河南工业大学粮油与食品学院；LO2细胞株受赠于中山大学生物学院；脱氧雪腐镰刀菌烯醇标准品购于新加坡Pribolab 公司；呕吐毒素酶联免疫试剂盒购于Romer 公司；色谱级甲醇、乙腈购于美国Honeywell 公司；DMEM 完全培养基、胎牛血清购于美国Gibco 公司；96孔板、T75透气瓶购于美国Corning 公司；DMSO 、MTT 购于美国Sigma 公司；双抗（青链霉素）购于中国索莱宝公司。
1.2 主要仪器设备
全自动凯氏定氮仪Kjeltec 8400（瑞典FOSS 公司）；COM-AD-01臭氧发生仪（鞍山安思罗斯环保有限公司）；254 nm 石英紫外灯(广东雪莱特光电科技股份有限公司)；QYN100-2氮吹仪（上海乔跃电子有限公司）；371二氧化碳细胞培养箱、生物安全柜 、酶标仪（美国Thermo 公司）；SBDY -1数显白度仪（上海悦丰仪器仪表有限公司）。
1.3 试验方法
1.3.1 臭氧熏蒸降解面粉中DON
取50 g 面粉置于500 mL 圆底烧瓶中，臭氧气体自磨口玻璃塞通入烧瓶，隔5 min 震荡一次，尾气引入
装有碘化钾溶液的尾气瓶。通过调节臭氧发生器转换率改变臭氧浓度，探究不同处理时间、不同臭氧浓度、面粉不同水分含量和不同DON 初始浓度对降解效果的影响。
1.3.2 紫外照射降解面粉中DON
取50 g 面粉用40目筛均匀铺撒在40 cm×60 cm 铁盘上，置于一个顶端悬挂254 nm 紫外灯的密封暗箱中。通过改变样品和石英紫外灯之间的距离改变紫外照射强度，探究不同照射时间、不同照射强度、不同面粉水分含量和不同DON 初始浓度对面粉中DON 降解效果的影响。
1.3.3 面粉理化性质测定
外国女歌手水分按照GB/T 21305-2007《谷物及谷物制品水分的测定常规法》进行，蛋白质含量按照GB 5009.5-2010《食品安全国家标准食品中蛋白质的测定》进行，湿面筋含量按照GB/T 5506.2-2008《小麦和小麦粉面筋含量第2部分：仪器法测定湿面筋》进行，面粉白度按照SBDY -1数显白度仪说明书测定。
1.3.4 DON 含量检测
DON 含量检测按照Romer 呕吐毒素酶联免疫试剂盒说明书进行。
1.3.5 MTT 法测细胞活性
LO2细胞在透气培养瓶中用DMEM 完全培养基在37 ℃，5% CO 2条件下培养至对数期。将处于对数期的细胞按照1×104/孔密度接种到96孔板中，在37 ℃，5% CO 2条件下培养4~6小时，待细胞充分贴壁后，实验组去掉培养基，将经过DMEM 完全培养基稀释的不同浓度DON 标准品溶液和相应浓度的臭氧降解产物、紫外降解产物溶液加到96孔板中，空白组不处理，培养48 h 后去掉培养基，加入20 μL 浓度为5 mg/mL 的MTT 溶液在37 ℃下反应4 h ，待结晶充分形成后加入150 μL DMSO 溶解，避光振荡15 min 后将96孔板放入酶标仪在570 nm 处检测光密度OD 值。
%100OD OD ×=
值
空白组值
实验组细胞活性
1.3.6 数据计算和分析
每个样品做3~6个平行，用Origin 8和IBM SPSS
Statistics 19.0对数据进行统计分析。
2 结果与讨论
只争朝夕197
2.1 面粉样品
四种面粉样品中DON 含量和基本理化指标见表1，其中DON 含量均超过了国家标准规定的最高限量（1 mg/kg ）；随着样品DON 含量的增加蛋白质含量、湿面筋含量和白度值都随之降低，这可能是由于污染严重的小麦制得的面粉DON 含量高，赤霉病使小麦
品质下降，蛋白质等营养物质含量降低，与蛋白质含量相关的湿面筋含量也随之降低，且赤霉病小麦籽粒小、质量轻、表皮皱缩，其中空麦、瘪麦多，制粉过程中容易混入更多碎麸星使得面粉颜色较深，同时赤霉病小麦中异色麦粒比例较高，也会使制得的面粉颜色较深[1]。
表1 样品初始DON 含量和理化指标
Table 1 Initial DON content and physicochemical properties of samples
样品 DON 含量/(mg/kg)
水分含量/%
蛋白质含量/%
奥尔良烤鸭湿面筋含量/%
白度值
1# 2.35±0.08d 12.35±0.25b 10.89±0.24a 26.59±0.28a 81.14±3.37a 2# 2.84±0.16c 13.45±0.08a 10.02±0.07b 25.67±0.30b 78.81±2.26a 3# 4.09±0.09b 11.99±0.34bc 9.92±0.18b 25.41±0.21b 77.75±1.87a 4# 4.95±0.04a 11.47±0.13c
9.95±0.11b 25.15±0.45b 76.57±3.34a
注：用Duncan 法进行多重比较，同列标有不同字母表示差异显著（p <0.05）。
2.2 臭氧熏蒸降解面粉中DON
2.2.1 臭氧处理时间对DON 降解效果的影响
取500 g 面粉样品4#，将水分含量调整至12.00%，调整臭氧发生仪使臭氧浓度为60.00 mg/L ，流速为1 L/min ，分别处理面粉样品10、30、60、120、180和300 min 。如图1所示，面粉中DON 降解率随着处理时间的延长而升高。处理时间达到60 min 时降解率为31.62%，进一步延长处理时间，降解率无显著变化（p >0.05）。表明到60 min 时，臭氧对DON 的氧化降解反应逐渐达到了平衡，为了提高臭氧利用率，本实验选择处理时间为60 min 来进行接下来的研究。
图1 臭氧处理时间对DON 降解效果的影响
Fig.1 Effect of exposure time on the degradation rate by ozone
2.2.2 臭氧浓度对DON 降解效果的影响
取500 g 面粉样品4#，将面粉水分含量调整至12.00%，分别用15.00、30.00、45.00和60.00 mg/L 臭氧以1 L/min 流速处理60 min ，如图2所示，随着臭氧浓度的升高，DON 降解率明显提高。臭氧浓度达到45.00 mg/L 时，降解率为29.42%，将臭氧浓度提升至60.00 mg/L 降解率无显著变化（p >0.05）（经SPSS
分析确认，此处p =0.086），说明臭氧浓度达45.00 mg/L 时降解反应逐渐趋于平衡，因此选择臭氧浓度45.00 mg/L 来进行后续试验。
图2 臭氧浓度对DON 降解效果的影响
Fig.2 Effect of ozone concentration on the degradation rate
2.2.3 面粉水分含量对DON 臭氧降解效果的影响
图3 样品水分含量对臭氧降解DON 效果的影响 Fig.3 Effect of moisture content of samples on the degradation
rate by ozone
取500 g 面粉样品4#，将其水分含量分别调整为
8.00%、12.00%、16.00%和20.00%。控制臭氧浓度为
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45.00 mg/L ，流速为1 L/min ，处理时间60 min 。如图3所示，随着面粉水分含量的提高，DON 降解率升高，说明较高的水分含量有利于DON 的降解，与Li M M 等的研究结果一致[6]。水分含量为16.00%时降解率为34.90%，再提高面粉的水分含量，降解率无显著提升（p >0.05）。Si-chu X [16]等认为臭氧具有强氧化性，作用于水分子后能释放出单原子氧和羟基等活性离子，从而将不饱和有机物氧化降解。样品水分含量较高时，受到相同浓度的臭氧作用产生的活性离子较多，有利于DON 的降解，但是当水分含量进一步提升时，在振荡过程中水分含量高的面粉容易形成粉团，阻碍了臭氧与面粉的充分接触；同时随着水分含量的升高，也会增强面粉中其他组分与臭氧发生反应的机会，与DON 竞争活性离子。由于较低的水分含量有利于面粉的储存，所以选择水分含量16.00%进行后续试验。
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2.2.4 不同DON 初始含量对臭氧降解效果的影响
图4 样品DON 初始含量对臭氧降解效果的影响 Fig.4 Effect of initial DON concentration on the degradation
rate by ozone
取面粉样品1#、2#、3#和4#各100 g ，将其水分含量调整至16.00%。控制臭氧浓度为45.00 mg/L ，流速1 L/min ，处理时间为60 min 。如图4所示，四种不同DON 含量的面粉样品经过处理降解率都可以达到35%以上，初始含量低的样品降解率较高。Li M M 等[6]
的研究中初始DON 含量为2.68 mg/kg 和10.06 mg/kg ，水分含量为16.60%和16.76%的小麦籽粒经过80 mg/L 的臭氧处理2 h 后DON 降解率分别为38.15%和35.40%。在该研究中使用的原料是小麦籽粒，
前人研究表明[17]麸皮中毒素含量最高，经过制粉分离后麸皮中DON 含量是小麦原始含量的2.7倍，仅有约29% DON 存在于面粉中，因此有理由认为在小麦籽粒中大多数DON 集中在表面，且麸皮组成成分简单，籽粒状态不易形成团阻碍臭氧的充分扩散，小麦籽粒中的DON 更易被降解，但是由于文中没有指出臭氧流速和物料质量与反应容器的比值，无法分析具体原因，因
此除臭氧浓度、处理时间和样品水分含量之外不同物料的表面特性和物料质量与反应容器的比值也有可能成为影响臭氧对DON 降解效果的因素。
周杰伦单曲2.3 紫外照射降解面粉中DON
2.3.1 紫外照射时间对DON 降解效果的影响
图5 处理时间对紫外降解效果的影响
Fig.5 Effect of exposure time on the degradation rate by UV
取500 g 面粉样品4#，将其水分含量调整为12.00%。调整盛放样品的铁盘和石英紫外灯之间的垂直距离，使样品处的紫外照射强度为1200 μW/cm 2。分别处理样品10、30、60、120、180和300 min 。如图5所示，紫外照射可以有效降解面粉中的DON ，当处理时间为60 min 时，DON 降解率达到29.56%，再延长处理时间降解率无显著变化（p >0.05）。小麦籽粒在磨制成面粉的过程中一部分麸皮表面积累的DON 会侵染到面粉中，紫外线降解真菌毒素的过程可能是由光化学反应产生的游离基引发的链式反应，紫外光的波长越短能量就越大，同时其穿透能力就越差，面粉中的DON 很难完全暴露于紫外光[12]。可认为处理时间为60 min 时降解反应逐渐达到平衡。所以选择处理时间为60 min 进行后续试验。
2.3.2 紫外照射强度对DON 降解效果的影响
图6 紫外照射强度对DON 降解效果的影响
Fig.6 Effect of UV intensities on the DON degradation rate
取500 g 面粉样品4#，将其水分含量调整为12.00%。调整样品和石英紫外灯之间的距离，分别在
600、800、1000和1200 μW/cm 2照射强度下照射60 min 。如图6所示DON 降解率随着照射强度的增
强显著升高（p <0.05），在照射强度为1200 μW/cm 2时降解率最高，达到29.70%，因此本实验选择1200 μW/cm 2的照射强度进行后续实验。有研究[18]认为由于设置不同的紫外照射强度是通过调节样品与石英紫外灯之间的距离实现的，样品距离紫外灯的距离越近照射强度越强，但是随着距离缩短，样品受到的紫外直射面积也会减小，因此照射强度较高时，真菌毒素的实际降解率应高于计算值。（降解率一直在增加，请解释没有
做超过1200 μW/cm 2的照射强度的实验）
（解释：受限于实验条件）。
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2.3.3 面粉水分含量对DON 紫外降解效果的影响
图7 样品水分含量对紫外降解效果的影响
Fig.7 Effect of moisture content of samples on the degradation
rate by UV
取500 g 面粉样品4#，分别将其水分含量调整至8.00%、12.00%、16.00%和20.00%，控制紫外照射强度为1200 μW/cm 2处理60 min 。如图7所示四种不同水分含量样品紫外降解效果无显著差异（p >0.05），本次试验选择的水分含量范围对降解效果影响不大，由于高水分含量不利于面粉的保存，本实验选择最接近四种面粉样品原始水分含量的12.00%进行后续实验。
图8 样品DON 初始含量对紫外降解效果的影响 Fig.8 Effect of initial DON concentration on the degradation
rate by UV
2.3.4 不同DON 初始含量对紫外降解效果的
影响
取面粉样品1#、2#、3#和4#各100 g ，将其水分含量调整至12.00%，在1200 μW/cm 2的紫外照射强度下处理60 min 。如图8所示，四种不同DON 初始含量的样品经过处理后降解率都可以达到30%以上，初始DON 含量较低的样品降解率较高。
2.4 臭氧熏蒸和紫外照射对面粉基本理化指标的影响
世胄
图9 处理前后面粉理化指标
Fig.9 Physicochemical indicators of flour before and after
treatment
注：a ，蛋白含量；b ，湿面筋含量；c ，白度值。
本实验从处理前后面粉蛋白质含量、湿面筋含量
和面粉白度的变化来研究臭氧和紫外处理对面粉品质的影响。如图9所示，经过臭氧处理后面粉的蛋白含
