拉雅松遗传多样性及同域分布种间亲缘关系分析
冯源恒;吴东山;王德俊;杨章旗;李火根
【摘 要】拉雅松是广西西北部稀有的乡土用材、用脂树种,有较高的经济价值,但其遗传多样性状况及种间进化关系未知.利用 SSR 分子标记检测拉雅松群体遗传多样性,希望对该物种保护策略的制定提供参考依据.此外,鉴于该地区自然分布的松属树种仅有拉雅松、细叶云南松与马尾松三个种,试图利用 SSR 分子标记信息分析拉雅松与细叶云南松、马尾松的种间亲缘关系.结果表明：7对 SSR 引物在拉雅松群体共检测到14个等位基因.有效等位基因数为1．653,观测杂合度为0．577,期望杂合度为0．374,Shannon 信息指数为0．540, Nei 多样性指数为0．367,表明拉雅松具有较高的遗传多样性.拉雅松与马尾松遗传距离最近为0．0175,与3个细叶云南松群体距离较远,平均为0．0525.拉雅松与马尾松、细叶云南松平均共祖系数(Θ)分别为0．094、0．066,据此推测拉雅松可能与马尾松存在较近的亲缘关系.讨论了拉雅松的遗传多样性保护策略.%Pinus crassicorticea is a rare tree species has high economical value in northwestern Guangxi.As the habitat has been riously damaged,P .crassicorticea is now regarded as an endangered species.To prerve the germplasm of th
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is species,the genetic diversity of P .crassicorticea was quantified bad on 7 SSR loci.The interspecies relationship be-tween P .crassicorticea and two sympatric pine species,P .uifolia and P .massoniana ,was further analyzed.The results showed that the mean number of effective alleles (Ne )per locus was 1.653,the average obrved heterozygosity (Ho )was 0.577,the expected heterozygosity (He )was 0.374,Shannon’s information index (I )was 0.540 and mean Nei’s gene diversity (h )was 0.376,indicating that P .crassicorticea maintains high levels of genetic vari-ation.The genetic identity (GD )was 0.0175 between P .crassicorticea and P .massoniana ,while 0.0525 between P . crassicorticea and P .uifolia .The interspecies relationship coefficient was 0.094 within P .crassicor-ticea and P .massoniana ,and 0.066 in P .crassicorticea and P .uifolia ,respectively.Therefore,it was reasonable that P .crassicorticea was genetically clor to P .massoniana than P .uifoli .The <br> strategy for the genetic resource conrvation of P .crassicorticea was also discusd in this paper.
皮虫【期刊名称】《广西植物》
【年(卷),期】2014(000)003
【总页数】6页(P320-325)
四年级教材【关键词】拉雅松;SSR;遗传多样性;同域分布;亲缘关系
【作 者】冯源恒;吴东山;王德俊;杨章旗;李火根
【作者单位】南京林业大学 林木遗传与生物技术省部共建教育部重点实验室，南京 210037; 广西壮族自治区林业科学研究院，南宁 530002;广西大学，南宁 530001;南京林业大学 林木遗传与生物技术省部共建教育部重点实验室，南京 210037;广西壮族自治区林业科学研究院，南宁 530002;南京林业大学 林木遗传与生物技术省部共建教育部重点实验室，南京 210037
【正文语种】中 文
【中图分类】Q347;S718.46
拉雅松(Pinus crassicorticea)为松科(Pinaceae)松属(Pinus)植物，因1989年首次在广西壮
族自治区雅长林场拉雅分场发现而得名。分布于乐业县南盘江南岸的雅长林区腹地，海拔500～1 200 m的丘陵山地。林木呈小片状分布于细叶云南松(P. yunnanensis var. tenuifolia)林中。其针叶、雌雄球花等形态特征均明显异于细叶云南松而与马尾松(P.massoniana)相近，惟树皮厚度、针叶树脂道数目等特征易与马尾松区分(钟聪业等，1990)。拉雅松的木材品质优良，陈金凤(1993)对广西松属10种木材的纤维测定发现，拉雅松木材的纤维长度和长宽比最大，是造纸和纤维工业的优质原料。拉雅松的松针精油在抑菌、抗氧化、杀虫等方面具有生物活性，有望开发成无污染的抑菌剂、抗氧化剂及驱避剂(李梓，2012)。拉雅松被视为广西具有重要发展潜力的乡土树种，但迄今为止，对拉雅松的遗传信息知之甚少；对其群体遗传多样性状况及与其它松树种间亲缘关系的了解仍较为欠缺。
随着分子生物学技术的发展，利用分子标记检测松属树种遗传多样性的报道较多，如油松(P. tabuliformis)(李明等，2013)、马尾松(谭小梅等，2012)、黄山松(P.taiwanensis)(唐娟娟等，2003)、思茅松(P. kesiya var. langbinanensis)(Chen et al.，2002)等；利用分子标记分析松属种间亲缘关系也有报道(陈凤英等，1997；洑香香等，2011)。简单重复序列(Simple Sequence Repeats，SSR)因其具有多态性高、共显性、中性突变及遍布于整个基
因组等特点，广泛应用于遗传连锁图谱构建(Labbé et al.，2008)、亲缘关系分析(Dow et al.，1996)、遗传结构分析(Wyman，2003)、种间杂种鉴定(张红莲等，2010)以及基因流检测(Dow et al.，1998)等领域。本研究利用SSR分子标记对拉雅松的遗传多样性及其与细叶云南松和马尾松的亲缘关系进行研究，以期为拉雅松的种质资源保护、种间杂交育种以及种间进化关系等领域研究提供参考依据。
1 材料与方法
1.1 材料
材料于2011年11月采自广西壮族自治区乐业县境内的雅长林场拉雅分场。共采集拉雅松群体样本29株(编号LY1-LY29)，分布在海拔800～1 050 m范围内。为研究拉雅松与同域分布松属种间亲缘关系，同时采集3个细叶云南松天然群体样本及马尾松31株样本。其中马尾松样本取自南宁市林业科学研究所马尾松基因库。细叶云南松天然群体分别为广西乐业群体含30个样本、广西隆林群体含31个样本、广西西林群体含31个样本。
1.2 方法
1.2.1 DNA的提取与纯化 松树针叶DNA提取采用CTAB裂解—硅珠吸附法(Doyle et al.，1990)。纯化后DNA经分光光度计检测纯度后置于4 ℃冰箱保存备用。
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1.2.2 引物来源及SSR-PCR反应条件 本研究所用的SSR 引物来源于马尾松核基因组DNA 测序所得基因组序列设计开发，共计506对。筛选12对在拉雅松、马尾松及细叶云南松中通用性好的SSR引物用于本研究。PCR反应体系为10 μL：Tris-HCl 10 mmol/L pH 8.0，KCl 50 mmol/L，Mg2+2.5 mmol/L，dNTP(dATP、dCTP、dGTP、dTTP各0.2 mmol/L)，引物2.5 pmol，Taq聚合酶0.08 U，DNA 10～20 ng。扩增反应程序采用Touch-down PCR：94 ℃15 s，60 ℃15 s(△℃=-0.5)，72 ℃ 30 s，16cycles；再进入94 ℃15 s，52 ℃15 s，72 ℃30 s，10cycles；最后72 ℃延伸15 min。SSR-PCR产物在8%的聚丙烯酰胺凝胶上电泳，使用50 bp DAN Ladder为参照，银染检测并照相记录。对所得的图片进行判读，然后根据所读的数据用A，B，C，D，E…按条带长度大小从大到小进行编号。
蜜蜂的介绍1.2.3 天然群体的遗传多样性分析 采用POPGENE32软件(Yeh et al.，1997)计算各位点的观测等位基因数目(Na)、有效等位基因数目 (Ne)、Shannon多样性指数(I)、观测杂合度(Ho)和期望杂合度(He)、Nei基因多样度(h)。并利用该软件对每个位点单独和所有位点的W
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right固定指数(FIS=1-Ho/He)进行了估计，Wright固定指数用来指示取样种群是否偏离Hardy-Weinberg平衡，存在杂合子的过多或者缺乏。一般FIS值越接近于零，说明基因型分布越接近于平衡状态；FIS值越偏离零，基因型分布越偏离平衡状态。FIS值为正说明杂合子缺失，FIS值为负说明杂合子过剩。
1.2.4 种间亲缘关系分析 根据所获得的位点信息采用计算遗传距离与共祖系数两种方法分析拉雅松、细叶云南松及马尾松的种间亲缘关系。通过POPGENE32软件计算3种松树样本的Nei’s标准遗传距离(GD)，并采用软件NTSYS根据Nei 氏遗传距离，按非加权类平均法(unweighted pair groupmethod with arithmetic averaging，UPGMA)进行聚类，绘制聚类图。采用Coancestry Version 1.0软件计算3种松树彼此间的共祖系数Θ以比较其亲缘关系(Wang，2011)。
1.2.5 种间杂交检测 根据POPGENE32软件分析得到3种松树各位点的等位基因频率，研究种间杂交的可能性。采用Elston(1971)的最小二乘法估算杂种指数。通过对相同位点等位基因频率的回归分析(采用SAS 6.12软件)计算回归系数，并将该回归系数定义为杂种指数 (Bennuah et al.，2004)。
回归分析模型为Yij=aX1ij+bX2ij+c，式中Yij为拉雅松群体中第i个等位基因在第j个位点上的等位基因频率，X1ij表示细叶云南松群体中第i个等位基因在第j个位点上的等位基因频率，X2ij表示马尾松群体中第i个等位基因在第j个位点上的等位基因频率，回归系数a和b为杂种指数，c为截距。杂种指数a反映了马尾松对杂交后代的贡献率，杂种指数b反映了细叶云南松对杂交后代的贡献率。板材十大名牌
2 结果与分析
2.1 拉雅松天然群体遗传多样性
12对SSR引物中有7对在拉雅松群体扩增出多态性产物，多态率为58.3%。这7对引物共检测到7个位点14个等位基因，每个位点平均观察等位基因数为2；平均有效等位基因数1.653。人的生命只有一次
表1列出了拉雅松不同位点的遗传多样性参数。不同位点的多样性参数值差别很大，PF312位点的Shannon信息指数最高为0.691，PF390位点的多样性指数值最低为0.168，平均为0.540。拉雅群体的观测杂合度为0.577，期望杂合度为0.374，Nei多样性指数为0.367。Wright固定指数平均为-0.466，说明群体内杂合子过剩。
表 1 拉雅松遗传多样性参数Table 1 Genetic diversity of Pinus crassicorticea位点Locus观察等位基因数Na有效等位基因数NeShannon信息指数I观测杂合度Ho期望杂合度HeNei多样性指数h固定指数FISPF38221.5720.5500.4780.3720.364-0.314PF30321.9380.6770.8210.4930.484-0.697PF31221.9910.6910.9310.5060.498-0.871PF31921.9630.6840.8620.4990.491-0.758PF34921.7150.6080.5930.4250.417-0.421PF39021.0830.1680.0800.0780.077-0.042PF40221.3120.4010.2760.2420.238-0.160Mean21.6530.5400.5770.3740.367-0.466
2.2 种间亲缘关系
采用POPGENE32软件分析得到4个天然群体与马尾松对照群体的遗传距离。拉雅松群体与马尾松对照群体距离最近为0.0159，与3个细叶云南松群体距离较远，平均为0.0525。采用NTSYS软件根据POPGENE32软件分析得到的遗传距离进行聚类分析，获得聚类图(图1)。采用Coancestry Version 1.0软件计算得到拉雅松与马尾松个体间平均共祖系数(Θ)为0.094，而拉雅松与细叶云南松的共祖系数则为0.066。两种分析方法的结论都说明拉雅松与马尾松具有较近亲缘关系。
2.3 种间杂交检测
从亲缘关系分析结果可知拉雅松与马尾松亲缘关系更近，这与形态学上对二者针叶、雌雄球花的观察结论相一致，且两个种的花期也接近(钟聪业等，1990)。但拉雅松呈片状分布于细叶云南松林中(钟聪业等，1990)，管胞分子尺度与细叶云南松极其相近，且明显大于马尾松(牟继平，1993)。因此，拉雅松也有可能是由于马尾松与细叶云南松长期渐渗杂交而形成的。
