第20卷 第1期
2004年3月福建师范大学学报(自然科学版)Jo ur nal of F ujian N or mal U niver sity (Nat ur al Science Edition)V ol.20 N o.1M ar.2004文章编号:1000-5277(2004)01-0074-04
次氯酸钠-氯仿提取球衣菌PHB 的研究
许旭萍1，陈接锋2，谢华玲1(1.福建师范大学生物工程学院，福建福州 350007; 2.福建省宁德市人民政府农业办公室，福建宁德 352100)
摘要：利用次氯酸钠-氯仿从球衣菌中提取P HB，研究了次氯酸钠浓度、作用时间、作用温度以及SDS
对提取率的影响.实验结果表明：次氯酸钠处理的最适条件为5%NaClO ,10%SDS，温度35℃，时间5m in.
在此条件下P HB 提取率可达56%，纯度与标准品相同.
关键词：球衣菌;PHB ；次氯酸钠；提取
中图分类号:Q 936 文献标识码:A
Study on Poly -hydroxybutyrate (PHB )Extraction
from S p haerotilus natans by Sodium Hypochlorite -chloroform
XU Xu -ping 1,C HEN Jie -f eng 2,XIE Hua -ling 1
(1.B ioengineering College ,Fu j ian N or mal U niver sity ,Fuz hou 350007,China ;
鸡蛋木耳怎么炒2.Fuj ian N ingd e Gov er nment A gr icultural Of f ice ,N ingde 352100,China )
Abstract :A m ethod for ex traction PHB fr om S .natans FQ40by using so dium hypo chlorite-chlo-roform w as studied .T he factors ,including concentration of sodium hy pochlorite ,reactio n time ,tem-peratur e and SDS w ere optimized.The results sho wed that the o ptimal ex tr action conditions w ere the cells being treated w ith 5%sodium hypo chlorite and 10%SDS at 35℃fo r 5min.At this conditio ns,the ex traction rate could r each 56%,and the purity o f PHB w as coincident w ith the standard PHB .
体育媒体Key words :Sp haerotilus natans ;Poly -hy dro xybutyrate (PH B );NaClO ;ex traction
PHB 是细菌细胞内积累的一种高分子聚合物，是制造生物降解塑料的重要原料.PHB 的性质不仅与目
前普遍使用的合成塑料聚丙烯很相似，而且还具有生物可降解性和生物相容性等优点，在医学上具有重要作用.球衣菌营养要求简单，生长迅速，是合成PHB 新的菌种资源.但是该菌细胞外具有衣鞘，离心获得的菌泥粘稠，水分多,PHB 提取难度较大，提取率较低.NaClO 可与细胞中的非PHB 杂质发生氧化还原反应，使非PHB 杂质分子降解成可溶于水的小分子，具有破坏细胞壁的结构，使PH B 从细胞内释放出来的作用.已有文献报道NaClO 法可有效地用于真氧产碱杆菌和重组大肠杆菌的PHB 提取[1-2].但该法能否适用于含衣鞘的球衣菌，尚未见详细的报道.本文作者采用NaClO 作为提取剂，探索不同条件对提取效果的影响，以期建立一种简便、经济、有效的提取工艺.
作者简介：许旭萍(1962— )，女，福建福州人，副教授.
基金项目：福建省教育厅基金资助项目(K20097)
收稿日期:2003-11-10
1 材料与方法
1.1 菌种
球衣菌(Sp haerotilus natans )FQ40系作者从福州祥坂污水处理厂活性污泥中分离获得.
1.2 发酵液的制备[3]
FQ 40斜面菌种种子培养液30℃150r /min ,18h 发酵培养液30℃150r /min ,40h 获得发酵液，用于提取
PHB.
1.3 PHB 提取
1.3.1 细胞制备:100m L 发酵液,4000r /min 离心20min ，菌体用蒸馏水洗涤、离心，冰冻备用.
1.3.2 NaClO 处理法[1]：将离心获得的湿菌体悬浮于蒸馏水中，加入一定量NaClO 溶液，使其总体积为50mL，在一定温度的水浴中搅拌处理.
1.3.3 SDS-NaClO 混合处理法[2,4]：将离心获得的湿菌体悬浮于4
2.5m L 蒸馏水中，加入100g/L 的SDS 5m L ，在水浴中搅拌处理10m in ，然后再加入2.5mL NaClO 溶液，继续搅拌处理5m in .
1.3.4 PHB 抽提：采用以上方法处理后的菌液以4000r/min 离心20min，沉淀用蒸馏水和丙酮各洗涤一次，于60～70℃下烘干.干品用15m L 氯仿于60℃抽提60m in 后，过滤，滤液加热蒸发，除去氯仿，析出PHB ，再用丙酮和乙醇各洗涤一次,60℃烘干，得到白色粉末或薄膜状PHB .
1.4 PHB 含量测定[5-6]
青榄
采用Law 等紫外分光光度检测法测定PHB 含量.
1.5 气相色谱分析GC
[7-9]准确称取1～10m g 提纯的PHB 样品或1～10mg 标准品，加入1mL 氯仿和1mL 酸化甲醇(含体积分数3%浓硫酸和体积分数0.02%作为内标物的苯甲酸)，用四氟乙烯橡皮塞盖紧试管口，在100℃水浴中甲酯化4h，冷却至室温，加1mL 蒸馏水充分震荡,3000r /min 离心5min，混合液分为两相：下层为溶有PHB 的氯仿相；上层为硫酸和亲水性成分的水相；两相界面有少许固形物.将溶解在氯仿层中甲酯化的PHB 单体用气相色谱进行分析.气相色谱条件: 3.5%PEGA ,2m 柱长，载体为氮气，流速为40mL/min，进样器温度为200℃，检测器温度为250℃，柱温80℃维持2m in，然后以20℃/min 升高至195℃，维持3min，采用FID 检测.纯度表示方法：样品与标准品的相对峰面积之间谢亚旭
的比值.
1.6 核磁共振分析(NMR )[10]
图1 NaClO 体积分数对PHB 提取率的影响在Varian U nity-500核磁共振仪上进行分析.以CDCl 3为溶剂，样品体积分数为0.5%，采用5mm bb 探头，在26507.6Hz 宽，以125.677M Hz 观察记录碳谱(13C-NM R)；采用5mm PFG 探头，在6068.9Hz 宽，以499.807M Hz 观察记录氢谱(1H-NM R).2 结果与分析
2.1 不同因素对提取效果的影响
2.1.1 N aClO 体积分数对PHB 提取的影响：设置了不同NaClO 体
积分数进行试验，图1表明，当NaClO 体积分数为5%时提取率达到
最大，为55.2%，随着NaClO 体积分数的增加，因PHB 被降解而使
提取率逐渐下降.试验过程中还发现，如果菌体经NaClO 处理后不烘
干，而在水相中直接利用氯仿进行抽提，其提取率则明显降低，仅有
17%左右.而且与NaClO 体积分数变化关系不大，这是因为湿菌泥很
粘稠，搅拌困难，不利于PHB 从水相转移至氯仿相中，造成损失.75 第1期 许旭萍等：次氯酸钠-氯仿提取球衣菌P HB 的研究
2.1.2 NaClO 处理时间对PHB 提取的影响：以体积分数为5%NaClO 分别搅拌处理5、10、20、30、40min .结果(图2)表明，当菌体用5%NaClO 处理5min 时，其提取率最高，若延长处理时间，可能会引起部分PHB 降解，从而降低提取率.
2.1.3 NaClO 处理温度对PHB 提取的影响：处理温度对细胞的破壁效果有着较大的影响，温度过低或过高都会影响NaClO 的处理效果.图3表明，当温度为20～35℃时，随着处理温度的升高，提取率逐渐提高，至35℃时，达到最高，为54.7%，当温度继续上升时，提取率开始下降.
图2 提取时间对PHB
提取率的影响图3 处理温度对PH B 提取率的影响2.1.4 SDS -NaClO 混合处理对
PHB 提取的影响：采用SDS-Na-
ClO 混合处理来提取PHB .试验结
果表明，经过混合处理后,PH B 的
提取率可达56%，略高于单独用
NaClO 处理.提取获得的PHB 样
品经气相色谱分析，其纯度与标准
品(美国Aldrich Chemical Com pa-
ny Inc 产品)一致.Helenias 认为先
加入SDS ,SDS 首先作用于脂类和
蛋白质，使细胞膜受到破坏，随后
加入NaClO 可破坏细胞壁的网状结构使之成为溶于水的物质，从而可以增大非PHB 杂质的去除率，提
高PHB 的纯度和含量.
2.2 提取物的定性和定量分析
2.2.1 提取物的NMR 分析：用核磁共振仪分析测定所得样品的碳链骨架结构，所得碳谱图77×10-6处的吸收峰由溶剂CDCl 3产生.此外，有4个吸收峰，分别位于19.641,40.644,67.485,169.036×10-6，与标准品PHB 及文献提供的数据基本一致，它们分别代表聚合物中的4组碳原子(即CH 3,CH 2,CH 和COO 基团中的碳原子).测得的氢谱7.256×10-6处的吸收峰由溶剂CDCl 3产生；另外的几个吸收峰，分别位于(1.249,1.262);(2.435,2.447,2.466,2.477,2.566,2.581,
花开有声2.597,2.612);(5.233,5.246)×10-6，与标准品PHB 的一致，分别代表
CH 3CH 2和,CH 中的氢原子.图4 样品的气相色谱图2.2.2 提取物的GC 分析：用气相色谱对提取获得的PHB 样品进行定性、定量和纯度分析.定性分析表明，样品的主要组分和标准品的校正保留时间分别为2.204和2.189，基本一致，为同一物质.同时采用内标法进行定量分析(图4)，测得菌株FQ 40经过发酵培养基和发酵条件优化后，其胞内PHB 含量可达细胞干质量的48%，用SDS-NaClO/氯仿法提取获得的PHB，经气相色谱对其纯度分析表明，样品与标准品的相对峰面积之比为1.02∶1，可见其纯度不低于标准品，符合工业化应用的要求.而单独使用NaClO 提取，样品与标准品的相对峰面积之比仅为0.89∶1.
3 结论
(1)采用NaClO -氯仿法提取球衣菌胞内PHB ,NaClO 体积分数、
处理时间及处理温度均对提取率有显著影响,NaClO 处理的最适条件
夏侯渊工厂车间现场管理为5%NaClO ，温度35℃，时间5min .
(2)采用SDS-NaClO-氯仿混合处理，提取效果优于单独使用Na-
ClO-氯仿，提取率为56%，与单独使用NaClO-氯仿相当，但纯度明显76福建师范大学学报(自然科学版) 2004年
提高，与标准品相同.
(3)菌体经处理后，若不烘干而直接在水相中利用氯仿进行提取、分液，其提取率仅为17%左右，明显低于烘干样品.这是因为菌液粘度大，搅拌困难，不利于PHB 从水相转移至氯仿相中，损失较大.参考文献:
[1]潘贵全，盛青，秦杰.次氯酸钠/氯仿混合液提取P HA 的初步研究[J].化工冶金,1999,20(3):286-289.
[2]尹进，于慧敏，李红旗，等.用十二烷基磺酸钠纯化重组大肠杆菌中的聚- -羟基丁酸酯[J ].化工学报,1998,49
(3):353-357.
[3]陈接锋，许旭萍，佘晨兴，等.合成聚 -羟基丁酸(PHB)鞘细菌的分离、鉴定与筛选[J].工业微生物,2003,
33(4):1-4.
[4]尹进，于慧敏，李红旗，等.用SDS -NaClO 从重组大肠杆菌中分离聚 -羟基丁酸酯[J ].生物工程学报,1998,14
(3):342-344.
[5]陈银广，陈坚，堵国成，等.生物可降解塑料PHB 提取的研究进展[J].化工进展,1998,1:41-45.
[6]Jo hn H L ,Palph A S.A ssay o f poly-hy dr ox y buty ric acid [J].J.Bact erio log y,1961,82:33-36.
[7]T akeda M ,M atsuoka H ,Hamana H ,et al ..Bio sy nthesis of poly -3-hy dr ox y buty rat e by Sp haer otilus natans [J ].
A ppl.M icro biol.Bio tech.,1995,43(1):31-34.
[8]Br aunegg G ,So nnleitner B,L affert y R M .A r apid g as chro matog r aphic m et hod for the determinatio n of初一日记
poly - -hydro xy but yr ic acid in micro bial biomass [J ].Eur .J .A ppl .M icr obio l .Bio techno l .,1978(6):29-37.
[9]Y ves C ,K enneth J H ,William K O .Deter mination o f Po ly - -Hy dr ox ybuty rate and P oly - -Hydro xy alkano ates in
activated sludge by G as-L iquid Chr omat og raphy [J].A ppl.Envir on.M icr obio l.,1988,54(9):2325-2327.
[10]D oi Y ,K awag uchi Y ,N akamura Y ,et al..N uclear mag netic reso nance st udies of Po ly (3-Hy dr ox y buty rat e)and
po ly pho sphate meta bo lism in alcalig enes eutro phus [J ].A ppl .Enviro n .M icr obio l .,1989,55(11):2932-2938.
(责任编辑 余 望)77 第1期 许旭萍等：次氯酸钠-氯仿提取球衣菌P HB 的研究
