盐酸甲醇溶液提取-气相色谱-质谱法
测定水生动植物样品丁基锡
肖小雨1，2贺根和1尹丽1黄翔峰* 2
1 (井冈山大学生命科学学院，江西省生态环境与资源重点实验室，吉安343009)
2 (同济大学环境科学与工程学院，污染控制与资源化研究国家重点实验室，上海200092)
摘要采用四乙基硼酸钠( N aBEt4) 为衍生剂，建立简单、高效的生物样品有机锡气相质谱(GC-M S)分析方
法。结果表明，冷冻干燥生物样品粉末0． 1 g 经15 mL 0． 035 m o l /L盐酸甲醇振荡提取1 h，定量提取液加入乙酸盐缓冲溶液( pH 4．8) 调节溶液酸度，用含内标物正己烷2 mL 和0． 5 mL 2% ( m/V) N aBEt4水溶液衍生
萃取30 m i n后，GC-M S同时测定一丁基锡( MBT) 、二丁基锡( DBT)、三丁基锡( TBT) 。在0． 5 ～ 50 μg/L范围
内，线性良好，3 种有机锡加标回收率均在80% 以上。此方法能快速简单对复杂生物样品中的有机锡进行分
析，其检出限约为0．01 μg/L，3 个平行样测量值标准偏差都在10% 以内。
关键词盐酸甲醇溶液; 丁基锡; 气相色谱-质谱; 水生动植物
1
引言
有机锡化合物( OTCs) 作为聚氯乙烯( PVC) 稳定剂，农业杀虫剂，船体、海洋建筑以及钻井平台等的防污涂料已经在全世界范围得到广泛使用［1］。然而，OTCs 在防污防害的同时，也对环境中的非目标生物造成急性或者潜在的危害，尤其以生物杀灭剂三丁基锡( TBT) 危害最为严重［1 ～ 3］。研究发现，TBT 不仅毒性大，而且能干扰生物体内荷尔蒙的合成、分泌、输送等过程，进而影响生物体的正常生长、发育和繁殖等生命活动［4 ～7］，给人类的健康生活带来潜在的危害。
目前，生物样品有机锡分析的方法已经有较多报道［8 ～12］，且主要以气相色谱技术为主，但是该分析方法要经过一个复杂的前处理过程，主要包括提取、净化、衍生和萃取等4 个过程［1，2］，该复杂过程不仅
耗时而且容易造成较大误差。为了更加有效地减小误差，使整个分析操作过程更加简单和快捷化，本实验以盐酸甲醇溶液为提取剂，提取冻干生物样品OTCs，然后直接用Na B E t4衍生剂和正己烷萃取剂对提取液同时衍生萃取，省去了传统方法的中净化步骤，建立水生植物样品中丁基锡化合物G C-MS测定方法。
2 实验方法
2．1 仪器、试剂与材料
5975C 质谱仪( 配E I 源) 、7890A 气相色谱仪( 美国A g il en t公司) ; 6870 液氮冷冻研磨机( 美国TKISPE X 公司) ; F D-2C真空冷冻干燥机( 北京博医康实验仪器有限公司) ; KQ2200 B 超声清洗器( 上
海昆山公司) ; p H S-3C酸度计( 上海雷磁仪器厂) ; B S-224S电子分析天平( 赛多利斯科学仪器有限公司) ; 聚四氟乙烯试管。所有玻璃仪器及试管在使用前都经过10% HNO3 浸泡过夜，然后流水洗净，最后再用蒸馏水或纯净水洗干净，烘干备用。
三丁基锡( TBT) ，二丁基锡( DBT) ，一丁基锡( MBT) 和四丁基锡( TEBT) ，均购自上海S i g ma- Al dric h 公司，纯度均大于96% ；甲醇、正己烷( HPLC 级，美国Tedia 公司) ; 四乙基硼化钠( Na B E t
，
纯度
4
＞98% ，上海百灵威科技有限公司) ; 其它试剂均为国产分析纯。
小鲤鱼购自吉安花鸟市场，沉水植物金鱼藻取自赣江吉安段某支流，两种生物样品用去离子水和超纯水冲洗干净，在超低温冰箱中冷冻24 h，冷冻干燥72 h。碾磨粉碎，过100 目孔径筛，标记后放干燥器备用。
2014-05-13收稿; 2014-06-06接受
本文系国家科技支撑计划(No．2012BA C11B04)、江西省博士后科研择优资助(No．2014K Y45)和井冈山大学博士科研启动基金( No． JZB1310) 资助项目
* E-ma il: hxf@ tong ji．edu． cn
肖小雨等: 盐酸甲醇溶液提取-气相色谱-质谱法测定水生动植物样品丁基锡
第9 期1321 2．2 溶液配制
用甲醇溶液分别配制浓度为1． 0 g/ L 的TBT，DBT，MBT 标准储备液( TEBT 使用正己烷配制) ，浓度
以无机锡元素浓度计。根据需要，分别移取上述有机锡标准储备液配制相应浓度的有机锡标准工作溶液，并于冰箱中4 ℃黑暗保存不超过1 星期。
配制0．035 m o l /L H C l-甲醇溶液、2% ( m/V) Na B E t4溶液、3% ( m/V) KOH 溶液及相关缓冲溶液，其中
Na B E t
4
溶液新鲜配制，并且在24 h 内使用。
样品前处理
2．3
2．3．1 生物样品加标萃取准确称取0． 1 g 干燥生物样品于30 mL 的特氟龙样品管中，分别加入25 n
g 和50 ng 丁基锡混合标准工作液50 μL，样品管加盖密封吸附平衡后，分别用10 mL 0． 035 m o l /L
ipo是什么意思呢盐酸甲醇溶液和5 mL 3% ( m/V) KOH 溶液，振荡萃取60 m i n，转速300 r/m in，以6500 r/m in 离心
15 min，取上清液，用0．45 μm 聚四氟乙烯滤膜( 空白及前期研究结果［13］表明该材质对有机锡不吸附)
过滤后备用。同时增加OTCs的空白样品，所有样品做 3 组平行。
生物样品萃取取在实验室富集初始浓度为 3 μg/L TBT 5 天的小鲤鱼和金鱼藻。3 组平行生2．3．2
物样进行有机锡含量测定。
2．4 OTCs 的衍生和萃取
参考文献［11］关于O TCs在植物样品的衍生和萃取方法及文献［8］关于OTCs 在鱼类生物样品的衍生和萃取方法。本实验选取Na B E t4为衍生剂，正己烷为萃取剂，具体步骤为: 5 mL OTCs 提取液加入到装有40 mL 缓冲溶液的100 mL 容量瓶中，然后再加入0． 5 mL 2% Na B E t4溶液和2 mL 含50 ng T E BT 内标物的正己烷，加盖密封摇匀后恒温25 ℃条件下机械振荡30 mi n，转速为300 r/min，取出后加纯净水至容量瓶瓶颈( 不溢出) ，静置分层后取上层有机相进入G C-MS分析。OTCs 水样的衍生萃取步骤与生物样类似。
2．5 G C-M S 测定
色谱柱: D B-5MS色谱柱( 30 m ×0．25 mm，0．25 μm) ; 进样口温度为250 ℃；进样模式为不分流进
25 ℃/min
样，速度为100 m L/m i n，载气为氦气，EI= 70 eV; 柱温箱升温程序为: 60 ℃( 2 min) →230 ℃
( 2 m i n) ; 柱流速控制模式为恒流，流速1 m L/m i n; 初始压力为71．85 kPa; 进样量为1．0 μL。质谱离子
源温度: 250 ℃；接口温度: 280℃；溶剂延迟时间为6 min; 质谱检测模式为选择离子模式( S I M)，各丁基锡的保留时间和定量、定性离子见表1。
3 结果与讨论
3．1 衍生化条件的优化表1 GC-M S分析丁基锡的保留时间与S I M选择条件
Table 1 Ｒetent i o n t i m e and S I M factors of buty l t i n compounds by GC-M S
保留时间Ｒ
etent i on t i me
( m i n)
定量与定性离子
Qua li tat i ve i on and quant i tat i ve i on
( m/z)
丁基锡
B uty l t i n
263* ，207，291
263* ，207，261
179* ，235，233
179* ，177，233 三丁基锡T r i buty l t i n，T BT
二丁基锡D i buty l t i n，D BT 一
丁基锡Monobuty l t i n，M BT 四
丁基锡T etrabuty l t i n，T E BT
10． 20
8． 92
7． 41
11． 28
* 定量离子( Quan li tat i ve i on)。
3．1． 1 pH 对OTCs 衍生化的影响Na B E t
4
是大多数研究者首选的OTCs 衍生试剂，它已成功用于水
样、生物样、沉积物、土壤、木材以及其它物质中不同形态甲基锡、丁基锡、苯基锡、环己基锡等有机锡化
合物的测定［6，10，12，14，15］。为了解pH 值( pH 2．0，4．8，7．0，8． 0 和10．0) ［12］对NaB E t 衍生剂的衍生效果
4
［9］
的影响，0．5 mL 2% Na B E t4溶液分别对含10 ng 丁基锡混标物的水溶液衍生效率，各种OTCs在不同pH 值下经衍生萃取分析所得的G C-MS峰面积强度如图1 所示。从图1 可见，所有水样中加标O TCs的最大峰面积均发生在pH 4．8，但是内标物TEBT 在两组混标物中峰面积响应值相当，而且几乎不随pH 值变化，这主要是因为其不需衍生化就可以直接被G C-MS检测。这些结果表明，pH 值对O TCs 的衍生效率的影响较大，衍生和萃取效果整体上是随pH 值的增大而先增大后减小，这与文献［1，9，16］的结果一致。因此，综合考虑各O TCs的衍生效率，本实验选择1 m o l /L醋酸盐缓冲溶液( pH 4． 8) 作为生
分 析 化 学 第 42 卷
1322
物样品中有机锡化合物萃取衍生缓冲溶液。
3． 1． 2 衍生和萃取时间的影响 在上述选出的 pH 缓冲溶液( pH 4． 8) 条件下，继而研究衍生和萃取时 间
对 Na B E t 4 衍生效率的影响，10 mL 1 μg / L 的丁基锡混合标准溶液加入 40 mL pH 4． 8 缓冲溶液中，然 后再
分别加入 0． 5 mL 2% Na B E t 4 溶液和 1 mL 含 10 ng 内标 TEBT 的正己烷溶液同时进行衍生和萃取。 依据文献［8］报道，当衍生萃取反应超过 60 min ，所有 OTCs 的电信号强度能基本维持不变，因此，本实 验条件下，分别考察了反应 10，30，60 和 120 m i n 时有机锡的衍生萃取回收效率，结果如图 2 所示。从 图 2 发现，当反应时间为 30 m i n 时，所有 OTCs 的回收率都能达到 80% 以上，尤其是 TBT 和 D BT ，其回 收率基本达到 100% 。但是当反应时间增加到 60 mi n ，甚至 120 mi n ，各 O TCs 回收率增加量不超过 2% ， 因此，在保证分析准确的情况下，为了减少操作时间，本实验最终选取衍生化时间为 30 min 。
图 1 pH 对 N aBEt 4 衍生效率的影响
Fi g ． 1 E ffect of pH on der i v at i z at i o n efficiency of s o d i um tetraethy l b o rate ( N aBEt 4 )
图 2 萃取时间对 N aBEt 4 衍生化效率的影响
Fi g ． 2 E ffect of extract i o n t i me on der i v at i zat i o n efficiency of Na B E t 4
酸碱提取法对添加 OTCs 样品回收率比较
生物样品中 O TCs 常用的方法是酸提取法［10 ～ 12］和碱提取法［9］
，并通常以超声、机械振荡等辅助手 段增加提取效率。因此，本研究结合文献报道，首先选取对鱼和植物样均有良好提取效果的盐酸甲醇溶 液对冻干样品加标 O TCs 进行提取，然后依据前面获得的衍生和萃取条件进行分析，结果列于表 2。从 表 2 可知，当 0． 1g 生物样品中分别添加 25 和 50 ng 的 OTCs ，3 组平行样中各 O TCs 加标回收率的平均 值都能达到 80． 0% 以上，而且 O TCs 两个浓度水平的加标回收率基本一致。但是，不同 OTCs 之间，其回 收率略 有 差 别，其中以一取代有机锡的回收率最低。如 在 鱼 样 中，TBT 和 D BT 的回收率平均值在 96． 4% ～ 105． 0% ，而 MBT 仅在 81． 0% 左右; 相同的变化规律也能在金鱼藻样品中发现。这些结果与 Car li er -p i nasau 等关于O T Cs 在淡水白鲑［10］和S i m o n 等关于O T Cs 在水生植物伊乐藻［11］的研究结果基本
表 2 H C l -甲醇溶液提取生物样品中丁基锡化合物的加标回收率和精密度 3． 2 样品 Samp l es
鲤鱼 Carp
金鱼藻 Ceratophy ll um demersum L ．
平行样数
Dup li cate samp l es
25 ng 50 ng
25 ng 50 ng
丁基锡 B uty l t i n 回收率 Ｒecovery ( % ) 回收率 Ｒecovery ( % ) 回收率 Ｒecovery ( % ) 回收率 Ｒecovery ( % ) ＲSD
( % ) ＲSD ( % ) ＲSD ( % ) ＲSD ( % ) 1 2 3 1
2 3 1 2
3
104． 9 103． 2 100． 5 92． 0 96． 8 109． 8 84． 0 85． 3 94． 2
6． 5 5． 9 3． 5 5． 7 8． 5 7． 6 8． 4 9． 6 7． 9
91． 6 102． 9 100． 2 107． 8 111． 0 96． 6 88． 1 85． 0 84． 6
5． 2 3． 3 6． 8 4． 6 7． 1 8． 7 9． 2 8． 7 8． 2
100． 3 92． 5 96． 3 96． 2 102． 9 110． 2 96． 8 69． 6 77． 4
3． 5 5． 9 3． 9 5． 8 6． 4 6． 1 7． 2 8． 5 7． 8
98． 7 105． 8 109． 9 104． 1 95． 8 101． 4 80． 7 86． 6 77． 1
3． 5 2． 8 3． 2 5． 7 5． 6 5． 4 9． 0 5． 9 6． 2
TBT
D BT
MBT
肖小雨等: 盐酸甲醇溶液提取-气相色谱-质谱法测定水生动植物样品丁基锡
第 9 期
1323
一致，而化合物本身的理化特性差异( 如其在水中的溶解度以及疏水性等) 可能是造成 OTCs 回收率差 别的主要原因，其中 MBT 的溶解度最大，回收率最低。
其次，
T an g 等［9］
认为，富集在鱼体上 O TCs 往往是与鱼体各组织强烈结合在一起，采用强碱溶液将 鱼类等生物体完全消解，对测定生物体 OTCs 含量可能更加准确，他们的研究结果表明，以 KOH 溶液提
取标准参考鱼样中 TBT ，其回收率能达到 83% 以上。因此，本实验在上述文献的基础上，采用 3% K O H 溶液对上述加标 O TCs 的鱼样进行提取，然后经过同样的萃取衍生和测定步骤，最后所得结果见表 3。 从表 3 可见，KOH 溶液对鱼样中的加标 OTCs 具有很好的回收效果，OTCs 两个浓度的加标回收率均达 80% 以上。对于加标为 50 ng 的冻干鱼粉样品( 0． 1g ) ，其 3 组平行样中 TBT ，DBT 和 MBT 的加标平均 回收率分别为 103． 0% ，102． 5% 和 80． 7% 。这些结果与酸性提取液的效果类似，因此，两种方法都可以 用于实际鱼样样品中富集 OTCs 的 分析检测的前处理步骤。
表 3 碱性 KOH 提取鱼粉样品中丁基锡化合物的加标回收率和精密度
Table 3 Ｒec o very and ＲSD of standard add i t i o n of buty l t i n compounds in carp after K O
H s o l ut i o n e xtract i o n
鱼样富集 OTCs 酸碱提取法 3． 3 比较
样品 Samp l es
鲤鱼 Carp
25 ng 50 ng 平行样
Dup li cate samp l es
丁基锡 B uty l t i n 由上述结果可知，酸碱提取液 对冻干生 物样品中人工添加有机 锡的萃取回收率都能达到 80% 以 上，这与文献［8，12］的研究结果一 致。但是，人 工 添 加 OTCs 吸 附 到 死的生物 样品上与活生物体直接 从水环境富集 O TCs 应该具有本质 的差别，而采用这两种方法同时对 同一实际 环境生物样品有机锡含 量分析的对比研究还没有报道。
回收率 Ｒecovery ( % ) 回收率 Ｒ
ecovery ( % ) ＲSD ( % ) ＲSD ( % ) 1 2 3 1
草莓生日蛋糕图片2 3 1 2 103． 8 101． 6 99． 7 94． 9 96． 8 103． 5 80． 8 82． 1 5． 9 6． 5 6． 7 6． 7 7． 2 7． 4 9． 4 9． 9 107． 4 100． 2 101． 4 98． 5 103． 1 105． 8 81． 0 78． 2 4． 8 5． 1 5． 5 6． 2 6． 5 7． 5 8． 3 7． 6 TBT
D BT
MBT四年级作文小小动物园
3
77 ． 8 8 ． 7 82 ． 9 8 ． 1
因此，本实验分别采用 H C l -甲醇溶液和 KOH 对同一鱼样( 0． 1 g 冻干鱼样) 中富集的 TBT 进行提取对
比，并分别依据本实验和 Tang 等［9］ 获得的最佳衍生和萃取条件进行衍生和萃取，最后经过 G C -MS 分 析。结果表明，两种方法都能提取出生物体内富集的 TBT 及其相应代谢产物 DBT 和 M BT ，但是提取效
率不一样。通过计算发现，对于 TBT 来说，盐酸甲醇提取后的平均值为 2． 63 μg / g ( 干重) ，而 K手绘花盆
OH 提取 后的平均值为 2． 43 μg / g ( 干重) ，两种方法的检测结果相当( p ＞ 0． 05) ; 但是降解产物 DBT 和 MBT 在酸 性条件下检出结果却是碱性条件下检出结果的两倍或者两倍以上的关系，其中 DBT 平均值分别为 0． 12 和 0． 043 μg / g ( 干 重) ，MBT 平 均 值 分 别 为 0． 029 和 0． 011 μg / g ( 干 重) ，检测结果存在显著性差异 ( 0． 01 ＜ p ＜ 0． 05) 。因此，H C l -甲醇提取液能更加有效地将鱼体内富集的有机锡化合物提取到提取液中。 3． 4 线性关系和检出限
配制 0． 5 ～ 50 μg / L 的系列标准溶液，并加入 10 ng 内标物，按照水样处理方法衍生萃取，最终定容 至 1． 0 m L ，然后采用相应的GC -MS 检测条件分析测定，最后以有机锡和内标物的面积比( y ) 对有机锡 和内标物的浓度比( x ) 作线性回归分析，各有机锡 表 4 3 种丁基锡的内标准曲线的线性方程
Table 4 Linear re l at i o ns h i ps of i nterna l standard curv es of three
buty l t i n c o m p o unds 的 回 归 方 程 如 表 4 所 示。3 种 物 质 在 0． 5 ～ 50 μg / L 范围内线性均良好，回 归 系 数 Ｒ2
＞ 0． 相关系数 Corre l at i on coeff i c i ent ( Ｒ2 ) 线性方程 Li near equat i ons
检出限 998。并采用加标( 10 μg / L ) 样品进行平行测定， 得出各丁基锡的检出限为 0． 01 ～ 0． 12 μg / L ，详 见表 4。
如何提高团队凝聚力4 种丁机锡标准气相色谱图以及鲤鱼和 金鱼藻富集三丁基锡 后在酸性条件下的气相色 谱图 分 别 如 图3 ( a ，b 和 c ) ，其 中 图3 ( b 和 c
讥讽) 中 丁基锡
B uty l t i n L OD ( μg / L ) TBT D BT MBT
y = 0． 42x + 0． 001 y = 0． 37x － 0． 018 y = 0． 89x － 0． 026
0． 999 0． 999 0． 998
婚姻与家庭
0． 01 0． 05 0． 12
检查到的 MBT 和 DBT 均为 TBT 在动植物体内的降解产物。
分 析 化 学 第 42 卷
1324年夜饭图片大全
图 3 4 种丁机锡混合标准溶液气相色谱图( a ) 以及酸性提取条件下鲤鱼( b ) 和金鱼藻( c ) 体内丁基锡样品气相 色谱图
Fi g ． 3 But yltin gas chromatogram of the m i xed standard s o l ut i o n ( a ) and c arp ( b ) and C e rat o p hy ll um demersum L ． ( c ) samp l es extract i o n under acidic c o nd i t i o ns
结 论
4 生物样品中有机锡化合物分析方法一般要经过提取、净化、衍生( 气相分析系统) 、萃取和检测等
5 个过程。本研究以 0． 035 m o l / L H C l -甲醇溶液提取并配以 0． 5 mL 2% Na B E t 4 衍生和 1 mL 含一定内标 浓
度的正己烷萃取生物样品中有机锡化合物，最后通过 GC -MS 进行定性和定量分析，0． 1 g 冻干生
物 样品粉末中各种有机锡化合物的加标回收率均能到达 80% 以 上，最 佳 衍 生 pH = 4． 8，衍 生 时 间 为 30 m i n 。此方法不仅省去了传统生物样品中净化的步骤，有效减小了实验误差，而且能将衍生和萃取步 骤同时进行，使实验操作简单、快捷，是一种高效的有机锡化合物分析方法。实验发现，盐酸甲醇提取液 能更加有效地将鱼体内富集的有机锡化合物提取出来。 Ｒe f e r ences
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