中国畜牧兽医㊀2016,43(7):1667-1673
China Animal Husbandr y &Veterinar y Medicine
doi :10.16431/j .
cnki.1671-7236.2016.07.002鲁西黄牛MSTN 基因上游序列多态性
对转录表达的影响
王丹丹1ɦ，刘晓牧2ɦ，张㊀冉1，刘桂芬2，万发春2∗，林浴霜1∗
(1.
山东大学生命科学学院，山东省动物细胞与发育生物学重点实验室，济南250100;2.
山东省农业科学院畜牧兽医研究所，山东省畜禽疫病防治与繁育重点实验室，济南250100)摘㊀要：肌肉生长抑制素(m y ostatin ,MSTN )基因是转化生长因子-β(transformin g g rowth factor -β,TGF -β
)超家族的新成员㊂为了研究鲁西黄牛MSTN 基因上游序列多态性与转录表达的关系，本试验提取鲁西黄牛腿肌组织细胞的基因组，扩增出MSTN 基因上游序列，构建进化树并通过基因测序确定其上游序列中
存在单核苷酸多态位点，多态位点位于起始密码子上游805b p 处㊂构建表达载体，在体外对C2C12细胞进行转染，从而验证MSTN 基因上游序列多态位点对转录的影响㊂结果显示,MSTN 基因上游序列中单个核苷酸的改变会影响其下游基因的表达水平㊂推测在体内MSTN 基因上游序列中单核苷酸多态性能够影响基因的转录活性，在调节基因转录的过程中起着重要作用㊂
关键词:MSTN 基因；上游序列；单核苷酸多态性；转录表达
中图分类号:Q78㊀㊀㊀㊀文献标识码:A ㊀㊀㊀㊀文章编号:1671-7236(2016)07-1667-07
收稿日期:2016-01-11
基金项目：山东省农业良种工程重大课题"优质肉牛新品系培育"和肉牛优异品质种质创新利用研究；山东省攻关项目(2014GNC110028)作者简介：王丹丹(1991-)，女，山东曲阜人，硕士生，研究方向：动物发育,E -mail :wan g
刘晓牧(1974-)，女，山东阳谷人，副研究员，研究方向：反刍动物营养与饲料科学,E -mail : ;Tel :0531-********
童年梦想王丹丹和刘晓牧对本文具有同等贡献，并列为第一作者
少不更事的拼音
∗通信作者：万发春(1974-)，男，山东莒南人，硕士生导师，研究方向：肉牛的遗传育种和饲养,E -mail : ;Tel :0531-********
林浴霜(1976-)，女，山东济南人，硕士生导师，研究方向：动物发育及其基因表达调控,E -mail :lin y ushuan g @sdu.edu ;Tel :
0531-********
Effect of MSTN Gene U p stream Se q uence Pol y mor p hism on
Transcri p tional Ex p ression in Luxi Huan g Cattle
W ANG Dan -dan 1ɦ,LIU Xiao -mu 2ɦ,ZHANG Ran 1,LIU Gui -fen 2,W AN Fa -chun 2∗,LIN Yu -shuan g 1∗
(1.Provincial Ke y Laborator y o f Animal Cells and Develo p mental Biolo gy ,Li f e Science Colle g e ,
Shandon g Universit y ,J inan 250100,China ;2.Shandon g Ke y Laborator y o f Animal Dia
Control and Breedin g ,Institute o f Animal Science and Veternar y Medicine ,
Shandon g Academ y o f A g ricultural Sciences ,J inan 250100,China )
Abstract :M y ostain (MSTN )g ene is a member of transformin g g rowth factor -β(TGF -β)su p er -famil y .In order to stud y the relationshi p between Luxi Huan g cattle MSTN g ene u p stream -q uence p ol y mor p hism and the transcri p tional ex p ression ,
DNA was extracted from le g muscle cells of Luxi Huan g cattle and then q uenced.After anal y zin g MSTN u p stream q uence ,an ev -olutionar y tree was constructed and a SNP site was found at 805b p of MSTN u p stream q uence of initiation codon.Two ex p ression vectors contained the SNP site were constructed to transfect
the C2C12cells in vitro to stud y the influence of MSTN g ene u p stream q uence p ol y mor p hism
on transcri p tion activit y .The results showed that sin g le nucleotide chan g e on MSTN g ene u p stream q uence affected the ex p ression.It su gg ested that MSTN g ene u p stream q uence p ol -
y mor p hism of Luxi Huan g cattle would affect transcri p tion activit y and p la y an im p ortant role in
中㊀国㊀畜㊀牧㊀兽㊀医43卷㊀g ene ex p ression re g ulation.
Ke y words:MSTN g ene;u p stream q uence;sin g le nucleotide p ol y mor p hism;transcri p tional ex-p ression
㊀㊀分子生物学的迅猛发展对优良畜禽品种的选育和培养，尤其是大规模的发展畜牧业，具有重要的意义[1-2]㊂1997年,McPherron等研究发现了一种新的转化生长因子-β(transformin g g rowth factor-β, TGF-β)超家族基因，该基因可以编码一种称为生长因子-8(g rowth and differential factor-8,GDF-8)的蛋白质[3]㊂研究发现,GDF-8是一种骨骼肌生长负调控因子，可以抑制骨骼肌的生长，又被称为细胞生长抑制素(m y ostatin,MSTN),MSTN基因变异会导致肌细胞增生与肌纤维肥大[4-5]㊂研究还发现, MSTN基因对于控制畜禽肌肉增长及改善肌肉品质具有重要意义[6-8]㊂在人㊁牛㊁猪和鸡等物种中, MSTN基因由3个外显子和2个内含子组成[9-10]，其中人的3个外显子分别编码125㊁124㊁126个氨基酸,2个内含子分别长1.8和2.4kb，且其保守性很高[11-13]，说明该基因长久以来在生物体内发挥着重要的作用[14-15]㊂研究表明,MSTN基因上游序列中含有多个E-box区㊁MEF2和GRE区[16-17]，且在哺乳动物中还存在有MTBF或PRE调控位点[18]㊂通过研究E-box发现上游调控序列中存在的位点多态性会显著影响MSTN基因的转录水平[19-21]㊂因此，本研究以鲁西黄牛MSTN基因上游2.0kb序列为研究对象，一方面分析其基因多态性，另一方面通过细胞转染技术来验证基因多态性对该基因转录表达的影响㊂
1㊀材料与方法
1.1㊀样品采集
从山东省农业科学研究院畜牧研究所选取20头健康无病的1岁龄雄性鲁西黄牛，取其腿肌组织，置于液氮中保存㊂小鼠成肌细胞购自中国科学院细胞库㊂
1.2㊀主要试剂及仪器
TIANam p Stool DNA Kit购自天根生化科技有限公司;Ax y Pre p PCR Cleanu p Kit购自Ax yg en 公司;P f u酶购自碧云天生物科技有限公司;SYBR GreenⅠ试剂盒购自北京百泰克生物技术有限公司㊂电泳仪(DYY-8C型)购自北京市六一仪器厂；超微量核酸分析仪(NANO-200)购自杭州奥盛仪器有限公司;PCR仪(M y C y cler TM Thermal C y cler)购自美国Bio-Rad公司㊂
1.3㊀基因组DNA的提取
取鲁西黄牛腿肌组织样50~200m g，按照TI-ANam p Stool DNA Kit说明书提取肌肉组织的基因组DNA，琼脂糖凝胶电泳分析其完整性，并利用超微量核酸分析仪对其浓度和纯度(D260nm/D280nm)进行分析,-80ħ保存备用㊂
1.4㊀MSTN基因扩增和生物信息学分析
1.4.1㊀MSTN基因扩增㊀㊀根据已报道的牛MSTN基因上游启动子序列(GenBank登录号: NM_001001461)设计引物MSTN5U-F/MSTN5U-R(表1)，预计扩增片段大小约为
2.0kb㊂PCR扩增中所使用的酶是P f u酶，电泳检测PCR产物，用Ax y Pre p PCR Cleanu p Kit对PCR产物进行纯化，送铂尚生物技术(上海)有限公司进行测序㊂1.4.2㊀MSTN基因的生物信息学分析㊀㊀用NC-BI数据库BLAST及DNAMAN软件对所得鲁西黄牛样品的MSTN基因上游序列的测序结果进行比对分析，确定SNPs，并对该SNPs的基因型频率进行计算分析㊂将所得序列与GenBank中MTSN基因启动子序列：鲁西黄牛(登录号:KC405578.1)㊁野猪(登录号:KC405578.1)㊁人(登录号:NW_004078008.1)㊁小鼠(登录号:NT_039170.8)㊁鸡(登录号:KC405577)㊁斑马鱼MSTN a(登录号:NW_001878325.3)及MSTN b基因(登录号:NW_001879477.3)㊁热带爪蛙(登录号:ENSXETG00000009890)㊁斑胸草雀(登录号:ENSTGUG00000010861)构建系统进化树㊂
1.5㊀体外试验验证多态位点对转录的影响
1.5.1㊀CC基因型p EGFP-N1-M5U载体的构建㊀㊀利用AⅠ和SalⅠ对PCR扩增的鲁西黄牛MSTN 基因上游
2.0kb的片段进行双酶切，再用Ax y Pre p PCR Cleanu p Kit对酶切后的PCR产物进行纯化，然后通过T4连接酶将这两个片段导入到缺失病毒(CMV)启动子的p EGFP-N1载体中，构建真核表达载体p EGF
北京大学校门P-N1-M5U(模拟多态位点为CC的质粒，图1)㊂野生型引物M5U-F/M5U-R见表1㊂
8661
㊀7期
王丹丹等：鲁西黄牛MSTN 基因上游序列多态性对转录表达的影响
表1㊀试验中所用到的引物
Table 1㊀Primers ud in the test 引物名称Primer names 引物序列(5ᶄң3ᶄ简单日记
)Primer q uences
退火温度(ħ)
Annealin g tem p erature
产物大小Product size MSTN5U -F GAATTACATGCCCCCAACACTCTAT
56 2.0kb MSTN5U -R CCAGCAACAATCAGCATAAATAGGT
M5U -F ATGCATTAGTT ATTAATATTGAATTACATGCCCCCA
56 2.0kb
M5U -R
CCGCGGTACC GTCGAC ﹏﹏﹏﹏
CCAGCAACAATCAGCATAAATAG m5u -F GGAAGTAACTTAATA GTAGTCAATTG
56m5u -R CAATTGACTA CTATTAAGTTACTTCC GFPF CTCGTGACCACCCTGACCT
60
741b p
GFPR
TGTAGTTGCCGTCGTCCTTG 双下划线表示A Ⅰ酶切位点；波浪线表示Sal Ⅰ酶切位点；单下划线表示突变的位点
Double underline indicated A Ⅰrestriction sites ;Wav y line indicated Sal Ⅰrestriction sites ;Sin g le underline indicated the mutated
sites
图1㊀p EGFP -N1-M5U 重组质粒的构建
Fi g .1㊀Construction of recombinant vectors p EGFP -N1-M5U
9
661
中㊀国㊀畜㊀牧㊀兽㊀医43卷㊀
1.5.2㊀GG 基因型p EGFP -N1-m5u 载体的构建㊀
㊀以GG 基因型p EGFP -N1-M5U 为模板,
分别以M5U -F /m5u -R 和m5u -F /M5U -R 为引物(表1),PCR 扩增片段M5U -1(1202b p )和M5U -2
(876b p )㊂然后再以片段M5U -1和M5U -2混合作
模板，以M5U -F /M5U -R 为引物，融合PCR 扩增突变型基因M5U ，双酶切连入缺失CMV 启动子的
p EGFP
-
N1载体中(模拟多态位点为GG 的质粒)㊂1.5.3㊀细胞培养与转染㊀㊀将小鼠成肌细胞按
1ʒ2或1ʒ3传代，接种于T -25培养瓶中;
转染前用胰酶消化，离心后用完全培养基重悬计数；取1ˑ106个细胞，离心,100μL 转染试剂重悬细胞后,
加入2μg 质粒,
进行电转；将电转后的细胞加入到预热的500μL 完全培养基,脸部按摩器
瞬时转染48h 后，吸弃原有细胞上清，加入含G418筛选浓度的生长培养基；每隔
3~5d 更换一次含G418的培养基筛选细胞;
将细胞培养基更换为含2%马血清100μg /mL G418的
DMEM /F12培养基进行分化，并用实时荧光定量PCR 检测绿色荧光蛋白(g reen fluorescent p rotein ,
GFP )
的表达情况㊂ 1.5.4㊀实时荧光定量PCR 检测体外GF P 报告基因的表达㊀㊀48h 后收集转染后的C2C12细胞，提取细胞总RNA 并合成第一链cDNA ，选用GAPDH
(CW0918)为内参,GFP 引物GFPF /GFPR 见表1㊂
用SYBR Green Ⅰ试剂盒对GFP 的表达量进行实时荧光定量检测，每个样品做3组平行试验㊂由熔解曲线判定实时荧光定量PCR 的特异反应，利用
2-әәCt 得出GF P 基因的相对表达水平㊂
2㊀结果与分析
2.1㊀鲁西黄牛MSTN 基因上游序列分析
试验以鲁西黄牛腿肌组织作为研究对象，提取基因组DNA ,PCR 扩增MSTN 基因，用DNAMAN 软件对测序结果进行比对分析发现，在MSTN 基因
起始密码子上游805b p 处存在多态位点，结果见图
2㊂由图2可知，该位点有C ㊁G 两种等位基因,
存在CC ㊁CG ㊁GG 3种基因型,
其中CC 为野生纯合体,GG 为突变纯合体㊂CC ㊁CG ㊁GG 基因型频率分别为0.2500㊁0.3125和0.4375
㊂
A ,CC 基因型;
B ,CG 基因型;
C ,GG 基因型
A ,CC g enot yp e ;
B ,CG g enot yp e ;
C ,GG g enot yp e
不抱怨的世界图2㊀鲁西黄牛MSTN 基因上游启动子序列多态位点Fi g .2㊀The u p stream p romoter q uence p ol y mor p hism of MSTN g ene in Luxi Huan g cattle
2.2㊀系统进化树
对9个已知脊椎动物MTSN 基因的上游序列
(野猪(Sus scro f a )㊁人(H omo sa p iens )㊁小鼠(Mus
musculus )㊁鸡(Gallus g allus )㊁斑胸草雀(Taen -
io p y g ia g uttata )㊁热带爪蛙(Xeno p us tro p icalis )
㊁斑马鱼(Danio rerio ,MSTN a 及MSTN b 基因)
与鲁西黄牛(Bos taurus )
)
，构建系统进化树，结果见图3㊂由图3可知，鲁西黄牛MSTN 基因上游序列与野猪㊁人和小鼠构成一支，且和野猪的序列差异最
小；鸡和斑胸草雀构成一支；斑马鱼MSTNb 和热带爪蛙构成一支；斑马鱼MSTNa 自成一支，与其他物种中的MSTN 差别较大，进化分歧时间较早㊂
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㊀7期
王丹丹等：鲁西黄牛MSTN
基因上游序列多态性对转录表达的影响
图3㊀MSTN 基因上游序列系统进化树
Fi g .3㊀Ph y lo g enetic tree of MSTN g ene u p stream q uences
2.3㊀MSTN 基因上游序列多态性对其体外表达的影响
将构建的两个质粒p EGFP -N1-M5U 和p EG -FP -N1-m5u 质粒转染C2C12细胞,
实时荧光定量PCR 检测位点变化对于GFP 表达的影响,
结果见图4㊂由图4可知,GG 基因型p EGFP -N1-m5u 质
粒GFP 的相对表达量为CC 基因型p EGFP -N1-
M5U 质粒的0.54倍,
即在鲁西黄牛个体中MSTN 基因起始密码子上游805b p 处单核苷酸的改变可明显影响基因的表达水平，野生型个体(CC 基因型)可明显上调基因表达，说明该位点的变化可能会
引起一系列生产性状等的变化，这对于控制黄牛肌肉增长及改善肌肉品质具有重要意义
㊂
图4㊀MSTN 基因上游启动子序列SNPs 对GFP 报告基因体外表达的影响
Fi g .4㊀Effect of MSTN g ene u p stream q uence SNPs on the GFP re p ort g ene ex p ression in vitro
3㊀讨㊀论
世界上最大的鲸鱼真核生物的启动子包括核心启动子和上游启动
子元件，在转录起始位点-2000~+500b p 范围
内，包含有RNA 聚合酶和蛋白质因子的结合位点，含有基因表达调控的重要信息，并控制基因表达的起始时间和表达程度，可通过改变RNA 聚合酶和转录因子与调控序列的结合从而影响基因的表达水平[
22-23]梦见自己骑马
㊂MSTN 作用机理为抑制成肌分化抗原(m y o g enic differentiation anti g en ,M y oD )家族的转录活性并负向调控肌纤维的生长和发育，其表达量
与肌肉重量呈负相关[
24]
㊂MSTN 基因的缺失或突变会导致动物的 双肌 现象(double musclin g ,
DM )
，能明显增加肌肉的重量，还能够降低瘦素(le p tin )
的分泌，减少脂肪的形成，对脂肪沉积具有抑制作用，所以MSTN 可以作为研究畜禽肉质的重
要候选基因[
25]
㊂国内外已有不少关于MSTN 基因编码区或调控区的单核苷酸多态性对鸡㊁鸭㊁鹅㊁猪㊁牛㊁羊等肌肉发育的表型分析研究，这些结果为利用
MSTN 基因进行分子标记㊁选育稳定遗传的 双肌 畜禽奠定了基础[
26-27]
㊂本研究通过构建表达载体并转染细胞的方法,
对MSTN 基因上游序列单一核苷酸的改变与转录表达的关系进行了体外试验，首先通过基因扩增得到高浓度的目的基因，然后测序并进行分析比对，确定MSTN 基因上游序列确实存在多态性，位于起
1
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