氨基酸序列*测定综述
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【摘要】
氨基酸序列测定是一个较老的话题,早在20世纪30年代Pauling和Corey x-射线衍射方法研究氨基酸和肽。可是近几年关于氨基酸序列的测定并不多，测定氨基酸序列要花很长时间，到了较快捷分析ＤＮＡ的方法试用成功后，直接分析蛋白质的遗传密码比分析蛋白质本身更普遍。但该文仍然将对氨基酸序列测定相关研究进展作一综述。
【引文】
氨基酸是构成蛋白质的基本单位，赋予蛋白质特定的分子结构形态，使它的分子具有生化活性。蛋白质是生物体内重要的活性分子，包括催化新陈代谢的酶。两个或两个以上的氨基酸化学聚合成肽，一个蛋白质的原始片段，是蛋白质生成的前体。氨基酸广义上是指既含有一
个碱性氨基又含有一个酸性羧基的有机化合物，正如它的名字所说的那样。但一般的氨基酸，则是指构成蛋白质的结构单位。在生物界中，构成天然蛋白质的氨基酸具有其特定的结构特点，即其氨基直接连接在α-碳原子上，这种氨基酸被称为α-氨基酸。在自然界中共有300多种氨基酸，其中α-褐马鸡氨基酸21种。α-氨基酸是肽和蛋白质的构件分子，也是构成生命大厦的基本砖石之一。本文对相关研究进展作一综述。
【关键词】
氨基酸,序列;氨基酸序列测定
【正文】
1. 历史背景
我们的头发,指甲……以及对生命活动有催化作用的酶的成分都有蛋白质[1]。蛋白质
称为“生命活动的载体”，可见其对生命的重要性。于是科学家对其进行研究，希望找到它的本质，从而对它展开对人类有益的利用。
2. 前人的工作及成果粤剧名曲
2.1 x-射线衍射方法
20世纪30年代Pauling和Corey x-射线衍射方法研究氨基酸和肽
1963年Kendrew及同事利用x-射线分析技术分析了肌红蛋白结构
2.2 高效液相层析法分析
任勇等人应用高效液相层析法和微晶纤维素薄层指纹图谱法分析分析一例稀有β-链变异体:HbD Ouled Rabah [β19(B1)Asn→Lys]在我国人群中首次发现一例稀有β-链变异体:HbD Ouled Rabah [β19(B1)Asn→Lys]。先证者女,14岁,壮族,广西靖西县人。先证者母亲及其三个兄妹均为携带者,无明显临床症状。[2]
2.3 二维核磁共振谱测定
谭宁华等人在植物新环肽[太子参环肽A(HA)和B(HB)]的结构研究中,应用COL
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谱较成功地解决了氨基酸序列[3]
2.4 SDS-PAGE及蛋白质电泳印迹技术
周圆等人在直组人嗜中性白细胞活化蛋白-1/白细胞介素-8的纯化与鉴定
确证该目标蛋白得到高效表达和正确加工。随后采用Bio-Gel P30凝胶过滤层析和Mono-S阳离子交换层析对重组人NAP-1/IL-8进行了分离纯化,纯化产品达到SDS-PAGE纯。利用琼脂糖平板法测定了纯化产品的嗜中性白细胞趋化活性,推算其比活为2.8×10~5U/mg蛋白。又利用SDS-PAGE测出重组NAP-1/IL-8的分子量约为8.5kD,但根据凝胶过滤层析的洗脱时间推定,在溶液中确实存在分子量稍大于14.4kD的NAP-1/IL-8二聚体。[4]
2.5 蛋白质自动测序仪
用高效液相色谱技术 (HPL C)自华支睾吸虫粗抗原 (Clonorchis sinensis
Adultworm antigens,CAA)中提纯 15 / 16 ku蛋白 ,用酶联免疫吸附实验 (EL ISA)测定其抗原活性 ,并使用蛋白质自动测序仪测定其 N端部分氨基酸顺序。结果 3个具有抗原活性的纯化样品 (H3、H11及H13)中 ,H13的诊断效果接近 CAA,敏感性达 90 % ,特异性 95 %。分别测获 3个纯样的 N端 15、14和 2 0个氨基酸残基 (aa) ,其中 H11的 N端水星的卫星 14个 aa与 H13疫情短语的
前 14个完全相同。 结论 进一步证明了 Cs15 / 16为有效的诊断抗原 ,测获的部分氨基酸顺序可为更深入的研究提供参考。[5]
2.6 SDS- PAGE和 IEF测定
用制备型聚丙烯酰胺凝胶电泳和制备型等电聚焦纯化了曾报道的光敏核不育
水稻 (Oryza sativa)农垦 58S叶绿体的特异性蛋白质 P2 ,得到 SDS- PAGE和等电聚焦 (IEF )纯的 P2。经 SDS- PAGE和 IEF测定 ,该纯蛋白质的分子量是 61 k D,等电点是 5.8。现称 P2为 P61。氨基酸序列分析表明 P61的 N-端氨基酸序列与水稻和大麦叶绿体 ATPaβ亚基的 N-端氨基酸序列同源。[6]光电导
2.7 特异性的蛋白酶ｅｎｄｏｐｒｏｔｅｉｎａｓｅＬｙｓ－Ｃ和溴化氰对该酶
蛋白进行了裂解
作者对已报道的稻瘟菌诱导稻叶脂氧合酶ＣＭ－ＬＯＸ１和ＣＭ－ＬＯＸ２的纯化方法作了进一步改进和完善。改进后的纯化方法可缩短该脂氧合酶的纯化时间，并提高纯化倍数。
利用改进的方法，作者从２０ｇ非亲和性稻瘟菌小种接种稻叶中获得了电泳纯的酶蛋白ＣＭ－ＬＯＸ１１３３μｇ和ＣＭ－ＬＯＸ２２０８μｇ。在此基础上，采用特异性的蛋白酶ｅｎｄｏｐｒｏｔｅｉｎａｓｅＬｙｓ－Ｃ和溴化氰对该酶蛋白进行了裂解，回收其肽段，得到了ＣＭ－ＬＯＸ１的３个不同肽段共３０个氨基酸和ＣＭ－ＬＯＸ２的７个不同肽段共８７个氨基酸的序列，为最终克隆这２个酶的基因奠定了基础[7]
2.8液质联用、两种串联质谱
运用液质联用、两种串联质谱对融合蛋白FP3的氨基酸全序列测定,确证其一级结构。将样品还原烷基化后,通过胰蛋白酶酶解蛋白,PNGa F去除多肽混合物中糖肽的糖基化,将去糖后的总肽用于液质联用系统,通过液相分离后,运用Q-TOF和线性离子阱两种串联质谱测定各个肽段的b,y碎片离子,分析测定融合蛋白FP3的氨基酸全序列。[8]
3. 研究现状和问题
测定氨基酸序列要花很长时间，尤其是现在科学家更偏爱快速且更本质性的基因
测定，因此现在测定氨基酸序列的研究并不多。目前我国最近的对氨基酸的测定是2012年
LC-MS/MS 法对融合蛋白 FP3 的氨基酸全序列测定[8]
4. 未来前景
随着生物分子化学的研究，可能对氨基酸序列测定的方法和仪器会得到完善和突
破，那么科学家会继续对氨基酸直接测定。但就当今趋势，科学家们更愿意测定基因序列，在有对应的密码子翻译成氨基酸。[9]
【参考文献】
[1]. 赵赣,. 从酶的专一性看植酸酶与酸性磷酸酶的关系[J]. 生物学杂志,2010,(3)
[2]. 任勇,陈松森,梁植权,张慕洁,黄明学,张桂莲,曾宪生 中国医学科学院学报. 高效液相层析法分析一例稀有β-链变异体:HbD Ouled Rabah [β19(B1)Asn→Lys]
[3]. 谭宁华,赵守训,王德祖,张宏杰,陈昌祥,周俊 波谱学杂志：二维核磁共振谱测定植物新环肽—太子参环肽A和B中氨基酸序列. 帕金森综合症
[4]. 周圆,金冬雁,徐荣辉,侯云德 生物化学杂志：直组人嗜中性白细胞活化蛋白-1/白细胞介素-8的纯化与鉴定
[5]. Tan Ninghua , Wang Dezu , Zhang Hongjie Chen Changxiang , Zhou Jun and Zhao Shouxun( Department of Phyrochemistr China Pharmaceutical University, Nanjing, 210009; b Laboratory of Phytochcmistry, Kunming Institute of Botany, Academia Sinica, Kunming , 650204)
[6]. Wang Tai,Tong Zhe, Kuang Ting yun and Tang Pei song [WT6BZ]([WT6BX]Institute of Botany,Academia Sinica,[WT6BZ]Beijing [ST6BZ]100093)
[7] . Hou ZhanjunPeng Youliang (China Agricultural University, Beijing 100094) Randeep RakwalOsamu Kodama (Ibaraki University, Ibaraki 300-03 Japan)
[8]. LI Xiang1,GAO Xiang-dong2,TAO Lei1,PEI De-ning1,GUO Ying1,RAO Chun-ming1*,WANG Jun-zhi1* (1.Department of Recombinant Product,National Institutes for Food and Drug Control,Key Laboratory of the Ministry of Health for Rearch on Quality
and Standardization of Biotech Products,Beijing 100050,China; 2.School of Life Science and Technology,China Pharmaceutical University,Nanjing 210009,China)
[9]. 韦莉,刘爵,姚炜光,张方亮,周蛟. 我国禽脑脊髓炎病毒分离株全基因组的测定[J]. 病毒学报,2004
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