第42卷第-期2201年4月
分析测试学报
FENXI CESHI XUEBAO ((00031 of WUomoOl Analysis )
Vol. 42 Nc. 4371 -375
doi : 10. 3969/j. issn. 1004 -4457. 2021. 04・ 014
非衍生化高效液相色谱-串联质谱法快速检测
生物体液中草甘麟、草钱麟及代谢物
张云峰(*
*，赵 森4 ，常 靖1，任昕昕1 ，王爱华1 ，赵 鹏1 ，收稿日期：2222 -14-39；修回日期：222 - 20 - 23
基金项目：公安部科技成果推广引导计划(2222TGYDBGAES2)
*通讯作者：张云峰，硕士，副研究员，研究方向：体内药物分析,E - mail : 5226395@ qq. com
董林沛1，吴小军4张景然5 ，刘冰洁5破解qq空间相册
4.公安部物证鉴定中心，北京100038； 2.浙江警察学院 浙江省毒品防控技术研究重点实验室,
浙江杭州3 5053 ; 3.爱博才思亚太应用支持中心，北京5001)
摘 要：建立了一种非衍生化高效液相色谱-串联质谱快速检测生物体液中草甘麟、草鞍麟及其代谢物等8
种极性农药的方法。8种极性农药经Metnp A Supp 5阴离子色谱柱(154 mm x4. 0 mm , 5 p m)分离，以纯 水-200 mmol//碳酸氢鞍溶液(含0.0%氨水)为流动相进行梯度洗脱，负离子多反应监测(MRM)模式进行 检测。实验结果表明,8种极性农药在0.5~54ng/mL 范围内线性关系良好(0 >0. 29)，检岀限(S/NM3)为
0.08~0.3 ng/mL ，定量下限(S/NM10)为0.3-1 ng/mL 。方法的基质效应为86. 5% - 56% ，目标化合物的
回收率为81. 5%-114% ，日内相对标准偏差(RSD )为0.30%~2.8%，日间RSD 为0.54%~5.3%。该方法无
需复杂的衍生化过程，简便快速、灵敏度高、稳定性好，适用于生物体液中3种极性农药的检测。关键词：极性农药；非衍生化；生物体液；高效液相色谱-串联质谱
中图分类号：0657.63； S859. 81 文献标识码：A 文章编号：1004 -4957(202) )04 -0571 -06
Nov-derivativa Ra/ib Determination of GUphosate ； Glufosinate and T/eiz
Meta/olitev in Biologicol Fl/idv by Higd PeOormancc Lipnib
ChymaOgophy - Tandem Masz Spectomety
ZHANG Yun-feoy 1 * , ZHAO So 2 , CHANG Jby 1 , REN Xincin 1 , WANG Ai-dna 1 ,
ZHAO Peng 1 , DONG Lin-pei 1 , WU Xiao-jun 1 , ZHANG Jing-ran 5 , LIO Biny-jiv 5
(1. Ius/tute of Foreosie Scie/cc of Chi/a ； Beping 50033 , Chi/a ； 2. Key LaforaWy of Dog Preve/dox and Co/troi
Teck/ology of Zhejiang Provi/cc ； Zhejiang Police Colleye ； Ha/gzhoo 314053 , Chi/a ； 3. SCIPX Asia Pacific
App/caPox Support Ce/Or ； Beping 140015 , Chi/a )
Abstract ： Glyphosatv and glufosinate are a class of ooi —goic : —xcO/tOe and bOmOly suc-
dov herpicbas ； whdh h ave received more and more attention from the society. Much word afovt b-spectWv or ibeotiLcatiox of glyphosatv and glufosinate b the dmg-related cas are required as poisox- ing cas of this too herpicbas poisoxby , suicide and other caus also occur from time to doc. Topc机属于
UeveUp a Uetec/ov method for such herPdibas O ObUgdO Puibs ； a. g. Omod and uOnv could pro
vide a techndal siiypoW for Ov quaOtative and Uetec/ov of cas and poviba a y/ono for c/ndal toxic analysis and Oeatoeot. ThoOoc ； a —nCeOyatOe high peP'ormanco liquid ckromaOgragha 一
tandem mass spectomety was oOf U PO for Ov ragib Uetec/ov of 5 polar pesticides such as glyphg- sata and gU/obOv and their metafo/tvs b Ubmgdal /uids. 5 polar pes/cbas were parated on a
Metnp A Supp 9 anion column (19 mm X 2. 2 mm , 9 p m ) , with pure water -220 mmoUL am monium hypygo cardoxata solution covtabby 0. 1% ammonia water as moOila pha by graUieot v- lutiov , and analyzed O veya/ve ion multiple reaction moxibOng ( MRM ) mode. In this study : tha
ckomaOgraghic and mas s spectomety ondLOns for tha instmmeot were opdmizO , and tha Omod and uOne of ObUgUO Puibs were studied. The Omod and uO — samples were mixed with water and oscillated , then freeze -centrifugated with agpopriale amovnt of acetooitWle dr 10 min. The supeoig-
572分析测试学报第49卷
taut was in tuo pasd thpopO a COaneC PEP Plus soCX phaso extraction column and a9.22jm00 ganic micra-Aoous membraha；they collected Or analysis.Thv expe/medtat results showed that there were good/hear pOhonships Or5poOr pes/cOos in thv rango of9.5-50ng/mL with their correlation coef/ciests-r7-Orgor lhah9.99.Thv limits of detectwx（LOD,S/N三3）and thv limits of quantitation（LOQ,S/N M19）of this method were in thv ranpos of9.95-9.3n/mL and9.3-1 n/mL,respecSvelv.Thv matoo4/cts of thv method in bOoU and uCna were in thv rango of 统.5%-192
%,and thv recove/es Or thv target compounds ranged from51.5%to34%,with X i tra-Aap relative standard deviations-intra-Aap RSD,n=2 -and inter-Aap RSD of9.30%-2.5% and9.52%-2.3%,respecSvelv.With thv a/vantagos of simptv operahox,/mv-savOp and m/orl saving；high usitivity；good acc/raco and good reuobucibiXty；thv UeveOued method coulU ba ud Or thv ra/ib and acc/rata quahtative and qhanPtative analysis of5poOr pes/cOos:to meet thv testing and OestiXcahox repuiremests of gOphosato；gluOsinate-related toxic cas.
Key words:poOr pn/Okas；mu-Ae/vatpy;bmOpOP/uik;high peCboianco Uquib chomPogl ophy-tandem mass spectmmetp
草甘麟和草钱麟是一类非选择性、内吸型除草剂，在我国农业、林业中应用广泛，其生产量和使用量均位于世界前列1］。草甘麟和草钱麟的毒性不大，但具有致癌风险，因此受到社会越来越多的关注。此外，投毒、误服、自杀等原因的中毒（案）事件也时有发生［7—5］，因此草甘麟和草钱麟在涉毒案件的检验鉴定工作中需求较大。建立生物体液（血液、尿液）中此类除草剂的检测方法可为案件的定性和侦破提供技术支持，为临床毒物分析及救治提供参考依据⑷。
草甘麟和草钱麟进入人体后会发生代谢，草甘麟的代谢产物为氨甲基麟酸、N乙酰草甘麟、N甲基草甘麟；草钱麟的代谢产物为N乙酰氨甲基磷酸、3-甲基磷酸亚基丙酸、N乙酰草钱麟A4。草甘麟、草钱
麟及两者的代谢物均为强极性化合物，易溶于水。目前血液和尿液中草甘麟、草钱麟及代谢物的检测方法主要有分光光度法1］、高效液相色谱法1］、气相色谱法1］、气相色谱-质谱法14］、离子色谱法11］、离子色谱-质谱法12、高效液相色谱-串联质谱法（HPLC-MS/MS）11等。其中，分光光度法的专属性差，难以满足毒物分析特异性强、定性准确的要求；高效液相色谱法、气相色谱法、气相色谱-质谱法需进行衍生，操作复杂、不易控制、重现性差；离子色谱法易受生物基质影响，重现性差，适用范围窄。HPLC-MS/MS法具有灵敏度高、分析范围广、分析时间短等特点，近年来广泛应用于毒物分析领域19-15］。然而，目前已报道的血液中草甘麟的HPLC-MS/MS检测方法存在灵敏度偏低、基质干扰大、样本与标准品保留时间不一致等缺点，难以满足临床及刑侦、司法鉴定中对此类除草剂的高灵敏度、简单、快速、准确的检测需求。
本研究以血液和尿液为研究对象，选择5种极性农药及代谢物，包括草甘麟及其代谢物（氨甲基麟酸、N-乙酰草甘麟、N-甲基草甘麟）、草钱麟及其代谢物（N-乙酰氨甲基磷酸、3-甲基磷酸亚基丙酸、N乙酰草钱麟），采用非衍生化方法，建立了生物体液中草甘麟、草钱麟及代谢物等5种极性农药的HPLC-MS/MS法，为解决草甘麟、草钱麟涉毒案（事）件提供技术支持。
1实验部分
1.1仪器、材料与试剂
LC-30AD高效液相色谱（日本SUima/zh公司），配有Turbo V™离子源的TCpta Quad5520三重四极杆质谱仪（美国ScOa公司-；实验用水由Milli-C超纯水系统（美国Mil/yorc公司-制备。高速冷冻离心机（美国ThermoFiskar Scientific公司-;VoCex-Gesiv2可调速涡旋混合器（美国SI公司-；电子分析天平（德国SaCorins公司-；移液器和2mL离心管（德国EppeudoP公司-；碳酸钱和碳酸氢钱（色谱纯, Sigma公司）;COanert PEP Plus固相萃取柱（62mg/3mL，天津艾杰尔科技有限公司）。
草甘麟、草钱麟、氨甲基麟酸、N乙酰草甘麟、N甲基草甘麟、N乙酰氨甲基磷酸、3-甲基磷酸亚基丙酸、N乙酰草钱麟（纯度＞98%，德国LGC公司）；甲醇、乙月青、甲酸、甲酸钱（HPLC级，美国Fiskar Sciestific-;6cm定性滤纸（杭州新华纸业有限公司）。
第0期张5峰等：非衍生化高效液相色谱-串联质谱法快速检测生物体液中草甘膵、草钱膵及代谢物373
1.2标准溶液的配制
准确称取各化合物固体标准品10.2mg于10mL容量瓶中，用水溶解并定容，得到质量浓度为1.2
mg/mL的标准储备溶液，于4C避光储存。标准工作溶液由标准储备溶液用纯水稀释得到，现用。
1.3样品前处理
取0.2mL样品，力口入0.2mL%，混匀后加入0.2mL乙C，振荡混匀，冷冻离心5mb，取上清液，依次过CUaneW PEP Plus固相萃取柱和0.22p m有机微孔滤膜，收集滤液于样品瓶中，待分析。
1.4液相色谱条件
色谱柱：Metnp A Supp6阴离子色谱柱(16mm X2.2mm,6p m)；流动相：纯水(A)和220
mmol/L碳酸氢钱溶液(含0.1%氨水)(B)；流速为0.2mL/min；柱温为42C；进样量为5p L。梯度洗脱程序：0~0.5mib,10%B；0.9~1.2mid,5%-42%B； 1.0~4.2mO,40%-89%B； 2.0-5.2mb,80%-52.5%B； 5.2〜6.2mb,52.5%-95%B； 6.2-5.2mb,95%B； 5.2-5.1mb, 95%〜10%B； 5.1〜10.2mb,10%Bo
1-5质谱条件
离子源为电喷雾电离负离子模式(ESI-)；检测方式：多反应监测(MRM)；离子源温度为600C；
喷雾电压为-2570V；雾化气(GS1)为55pO(379.223kPa)，气帘气(CUR)为35pO(242.325kPa)；
辅助气(GS2)为45pU(310.275kPa)；碰撞气(CAD)为Hbh。所有分析物的保留时间、定量与定性离子对、去簇电压(DP)及碰撞能量(CE)见表1
表18种极性农药的质谱条件
Table1MS parameters of8polar pesdcides
No Compound ReWngov doo
(mix)
Precuoer
漫画人物绘画
(m/z)
Product ion
(m)
DP
(V)力量药水怎么酿造
CE
(V)
1Glyphosato(草甘麟)424555.920.2*,78.2-3-59-53 4AminomethyIpPospPovic acib(氨甲基麟酸)324559.365.2*,83.2-49-45,-55 3N-Aotyl glyphosato(N-乙酰草甘麟)5295019.065.2*,16.2-35-42,-5 4N-Methyl glyphosato(N-甲基草甘麟)4235180.079.2*,65.2-35-33-35 5Glufoi—W-草钱麟) 5.3259.920.2*,84.2-45-59,-22 6N-TceOmOomOhyl phophaW(N-乙酰氨甲基磷酸)4251134.065.2*,119.0-35-42,-22 5N亚cetyl gOifoi—to(N-乙酰草钱麟)4265220.065.2*,19.2-35-61,-29 85-MethylpPospPindc propionic”26(5-甲基磷酸亚基丙酸) 4.73131.025.0*,135.0-35-45,-5
*quandtaOva ion
2结果与讨论
2.1质谱条件的优化
在电喷雾离子源正、负离子模式下，先用针泵进样分析各目标化合物的单个标准溶液，使用一级全扫描确定母离子；再采用Poduct Wo Scan，设定碰撞能量初始值为5eV，以5eV为步长自动调节碰撞能量，得到2个响应值高的特征子离子。进一步优化去簇电压和碰撞能量，最终确定8种极性农药的检测1。
2.2色谱条件的优化
草甘麟和草钱麟属于强极性农药，在常规反相色谱柱上保留较弱。实验比较了3种适用于强极性化合物的色谱柱，分别为Metnp A Supp5阴离子色谱柱(17mm X2.2mm,5pm)、Acclaim TOnity Q1(100mm X3.2mm,3p m)和Toms DEA(100mm X 2.1mm, 1.9p m)。实验结果表明，Metnp A Supp5阴离子色谱柱对5种极性农药的保留时间适宜，色谱峰形良好。
在Metnp A Sup p5阴离子色谱柱上，以纯水为流动相A，比较了不同碳酸氢钱浓度(50、100、200、257mmoUL)和氨水含量(0.01%、0.05%、0.1%和0.2%)的流动相体系对8种极性农药色谱行为的影响。结果表明，以220mmol/L碳酸氢钱和0.1%氨水作为流动相B时，8种极性农药的色谱峰
574
分析测试学报第4卷
形良好，
响应值高，保留时间重现性好。综上，本文选择以Metop A Supy 5为 柱，200
mmoOL 碳
溶液(含4.1%氨水)和纯水为流动相 ，得到/ 农药标准品的总离子流图
(TIC)及MRM 色谱图见图(o
2
1比邻的意思
O I E S U P U I
N-Acetyl glyphosate
O 2S U 0U I
O U M S U 0U I
3 2
o
w .t:s u £U I
O U M S U 0U I
Glufosinate
3
2
o
w .t:s u £U I
图1 3种极性农药标准品的总离子流图及MRM 色谱图(5 n/mL )
Fig. 1 Toto- ion and MRM c/omatograms of 3 polor yes/cidcs standard solutions (5 n/mL)
22.3前处理条件的优化
为
检测结果的时
，对血液和尿液等生物体液的 理多采 机溶剂蛋 法。实验
甲醇和乙C 的蛋
，结 ，当样品直接使
机溶剂进行蛋 时，统 性
农药的回收率均偏低。这是由
标物的
强，样品 ，当有机溶剂 高时，影响 标
物的提取
，因此在蛋
加入纯水对样品进行稀释。稀释后的样品，用乙C 的蛋
优于甲醇，故本文选择乙c 作为蛋 剂。
血液样品经乙c 蛋白，冷冻高速离心后，
液会 ，可能是低温下脂类杂 溶剂中析出所致。PEP Plus 固相萃取柱对脂类物
的
，且无需活化，操作简单。实验结 :
明，上清液通过该柱后变为澄清透明的状态。优化的前处理条件如“1.3”所示。
2. 4基质效应
取0.2mL 血液或尿液样品，
“1.3”
进行提取，取 液作为标准溶液稀释液，选择
10、104 ng/mL 2个浓度水平采用本方法进行测定，并与“1.2”相应质量浓度标准溶液的峰面积作
比19]o 得出所有目标农药的基质效应为统.5%〜106%(见表2)，表明空白血液和尿液基质对3种农药 的检测影响
，本方法可 血液、尿液中3种农药的定量检测。
2.5 关系、检 与
使用空白血液样品的净化液，分别配制质量浓度为4.5、3 2、5、6、20、54 ng/mL 的基质标准
溶液，进样检测。以/种目标物的质量浓度为横坐标(x , ng/mL )，所得峰面积为纵坐标(.)进行线性
。并以信噪比S/N M 3时的质量
为检 (LOD ), S/N M10时的质量
为定量下限(LOQ )。
结 ，3种目标物在4.5-50 ng/mL 围内线性关系良好(e 7 >4. 05), LOD 为493-4.3 ng/mL
,
第0期张云峰等：非衍生化高效液相色谱-串联质谱法快速检测生物体液中草甘麟、草镇麟及代谢物575 LOQ为0.3-1—/mL(见表2)o
表28种极性农药的线性回归方程、相关系数、基质效应、检岀限和定量下限Table2Reyossiox equado/s；correUPox oeXiUexts(A),matrix eXects；limits of UeWctOu(LOD)and limits of
uua/OoOo/(LOQ)for8polar pes/cides
参字组词Compooud Linear equation p MatWx eXect
(%)
LOD
(ng/mL)
LOQ
想分手(ng/mL)
Glyphosato y=399.6245x+86.89485 2.99518926 2.51 AminomethyIpPospPovic acib y=394.558%+95.22014 2.999155 2.08 2.5 N-Acetyl glyphosato7=425.2095%+19.0888 2.99519628 2.1 2.5
N-Methyl glyphosate y-894.8482%+120.9892 2.998359 2.1 2.5 Glu/si—W y=548.2515+55.29995 2.995451 2.1 2.5 N-AceOmibomethyl phosphate7=738.2018x+55.555 2.9959124 2.1 2.5 N-Acetyl glu/si—O y=1140.565+124.144 2.99838625 2.08 2.5 5-MothylpPospPindc propionic acib y=413.252%+2.85520 2.995498.5 2.08 2.5
2.6回收率及相对标准偏差
取0.2mL样品，加入适量8种农药混合标准溶液，使其样品中质量浓度为100—/mL。按照“03”步骤进行提取，每个浓度平行2份，每日早、中、晚分别测定2次，连续测定9Uo分别求得血液、尿液样品的平均回收率以及日内、日间相对标准偏差(RSD)，结果见表3。由表3可知，血液和尿液中8种极性农药的加标回收率为51.9%-110%,RSD为1.1%~5.0%；日内及日间RSD分别为0.32%-2.5%和0.57%-5.3%。实验结果良好，满足法庭科学检验标准。
表38种极性农药的相对标准偏差及回收率5=6)
Table3ReUdve sOndard UeviatW/s(RSD)and receveries of8polar pes/cides5=6)
Compooud
InOa-day
RSD(%)
Inter-day
RSD(%)
知识产权宣传Blood U/ne
Reccvey(%)RSD(%)Reccvey(%)RSD(%)
Glyphosato 1.4 4.19521 4.39925423 AminomethyIpPospPovic acib12842456 4.052125 N-Acetyl glyphosato0.4 4.0912812185.942
N-Methyl glyphosate 2.62 2.528528 3.095.2123 Glu/si—W 4.83219421429812542 N-AceOmibomethyl phosphate 4.652354323114328 N-Acetyl glu/si—O12312591.0429114123 5-MethyIpPospPindc propionic acib 2.39 4.585.1 4.095.5429
2.7实际案例应用
2222年5月，吉林省某女子因家庭矛盾将其丈夫杀害，归案后供述曾购买除草剂服用，企图自杀。除草剂名称为“草
*麟”，办案单位提取了该女子的血液送检。取0.2mL血液，按照本方法进行分析，结果检出了草甘麟及其代谢物氨甲基麟酸、N-乙酰草甘麟和N-甲基草甘麟，其色谱图见图2o 结就明，本研究建立的方法可用于实际案例的检验。
3结论
本研究建立了血液和尿液中草甘麟、草钱麟等8种极性农药的非衍生化HPLC-MS/MS检测方法。与衍生化方法相比，该方法具有操作简便、省时省力、灵敏度高、准确性好、重现性好等优点，克服了以往LC-MS/MS检测草甘麟、草钱麟稳定性和重现性差的缺点，能够快速、准确地实现对生物体液中草甘麟、草钱麟等5种极性农药的定性定量分析，满足草甘麟、草钱麟涉毒案(事)件的检验鉴定求。
