文章编号(A rticle I D):1009-2137(2010)05-1235-05#论著#应用实时荧光定量PCR技术检测儿童急性淋巴
细胞白血病微小残留病
张亚停,罗招凡,方建培,郭海霞,黄科,李志光1
中山大学孙逸仙纪念医院儿科,广东广州,510120;
1香港中文大学威尔斯亲王医院儿科,香港,100142
摘要本研究旨在应用实时荧光定量PCR(rea l ti m e quantitative PCR,RQ-PCR)技术检测儿童急性淋巴细胞白血病微小残留病(m i ni m a l re si dua l d ia,M RD),采用B系AL L18对引物、T系A LL8对引物进行PCR反应扩增Ig/T CR基因重排,以Ig/TCR基因重排作为追踪的分子标记,应用S Y BR G reen I染料法对儿童A LL-M RD水平进行定量。研究结果表明:9例B-AL L患儿中有8例重排,找到患儿重排标记(m arker)的机率为88.8%;并对诱导化疗后(第33天)骨髓M RD检测发现,其M RD水平明显下降。结论:本研究证实Ig/TCR基因重排可作为检测儿童A LL M RD标记,SY BR g reen I实时荧光定量PCR是一种可靠的、相对敏感的、并且比较容易的作为常规检测。
关键词急性淋巴细胞白血病;微小残留病;实时荧光定量PCR;PCR引物
中图分类号R733.1;Q503文献标识码A
D etection ofM i ni m al Resi dual D ia i n Chil dhood Acute Ly m phoblastic Leuke m i a by U si ng R ea-l ti m e Quantitati ve PCR
ZHANG Ya-Ting,LUO Zhao-Fan,FANG Jian-Pei,GUO H a i-X i a,HUANG Ke,LI Ch i-Kong1
D epart m en t o f Ped i a trics,Sun Ya t-Sen M e m or i a lH os p it a l,Sun Yat-Sen Un i versit y,G uangz hou510120,Guangdon g Provi nce,C hina; 1D epart m ent of P ediatrics,Prince o fW a les Ho s p it a l,C h i ne Un i versity o fHong Kong,Hong Kon g100142,C h i na
紧锣密鼓的意思C orres pond i n g Author:FANG J i an-Pei,P ro f ess o r.Tel:(020)81332213.E-ma il:j p fan m
Abstract T his study w as purpo d to detect the m i n i m a l resi dua l d ia(M RD)i n ch il dhood acute l ym phob l a stic leukem ia(A LL)by usi ng rea l ti m e quantitati v e PCR(RQ-PCR).T he Ig and TCR gene rearrangem ents w ere a m p lif i ed by usi ng18pri m er ts i n B-A LL,8pr i m er ts in T-A LL;the A LL-M RD lev e ls w ere quan tif i ed by using RQ-PCR w it h SY BR g reen dy e stai n i ng and c l one specif i c Ig/TCR gene rearrangem ents as m o lecular m arke rs.T he re sults i ndicated that t here w ere8ca s show i ng g ene rearrang e m ents i n9B-AL L pa tien ts,m arker de t ec ti on rate fo r all s am ples w as88.8%,t he M RD lev e l on day33dur i ng i nduc tion tre
a t m ent decread si gn ifican tly.It is conc l uded that Ig/T CR g ene rearrange m en ts can be ud a s a m arker t o detect M RD i n ch il dhoo d AL L;the t echn i g ue o f QR-PCR w it h SY BR g reen dy e staini ng is re liab l e,re lati v e l y nsiti v e and easy perfo r m ab l e m etho d w h i ch can be ud i n ro uti ne detecti o n fo r chil dhoo d A LL.
K ey w ords acute l ym phob l a stic l euke m ia;m i n i m a l resi dua l dia;rea-l ti m e quantita tive PCR;PCR pri m ers
J Exp H e m a to l2010;18(5):1235-1239
标危儿童急性淋巴细胞白血病(acute l y m-phoblastic l e uke m ia,ALL)化疗的5年无病生存率(EFS)达70%-85%,但仍有10%-30%的患儿因疾病复发而导致治疗失败。目前研究认为,微小残留病(m i n i m al resi d ual dia,M RD)是白血病复发的根源,另一方面,过度治疗又增加了治疗毒性反应及发生第二肿瘤的风险。因此如何识别并检出患儿体内的MRD是目前儿童白血病治疗中需亟待解决的问题,这对白血病的疗效评价、预后判断和复发监测、实行个体化治疗等均有十分重要的意义。国际上一些大型的协作组,例如美国儿童肿瘤协作组(Ch il d ren c sOnco l o gy G roup,COG)、欧洲癌症研究和治疗协作组(Eur opean O rgan ization for Rearch and T reat m ent o f C ancer,EORTC)和国际BF M协作组(Inter nationa l B erli n-Frankfur-t M nster(BFM) study g roup,I BF M)已建立了检测M RD
的标准化方法,并根据M RD水平指导白血病的诊断和治疗取得了很好的效果,但目前国内尚无公认的白血病
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基金项目:中山大学5010计划资助项目(编号2007016);广东省科技计划资助项目(编号2009B060700023)
通讯作者:方建培,教授.电话:(020)81332213.E-m ai:l j pfan g2005 @
2010-03-26收稿;2010-05-06接受
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M RD定量的方法,为探讨国际上已报道的/标准0方法在我国推广的可能性,本研究模拟国外的研究成果,应用RQ-PCR的方法检测儿童急性淋巴细胞白血病微小残留病。
材料和方法
主要仪器
飞鸽牌离心机(上海安高科学仪器厂产品),G ene Am p PCR sy ste m9600(美国Per k i n el m er公司产品),AB I7000Sequence D ecti o n Sy ste m(美国应用生物系统公司产品),电泳仪(美国伯乐B i o Rad产品),W P-93-1型紫外分光仪(中国永嘉上塘教学仪器厂产品),凝胶图像分析系统BXT-20-M(英国U v itec公司产品)。
主要试剂
Fico l-l Paque Tm Plus(美国GE公司产品),Q iagen DN easy B lood&T issue K it(荷兰Q iagen公司产品),AB I PCR试剂盒(美国应用生物系统公司产品),上下游引物(上海英骏生物技术有限公司产品),琼脂糖(杭州微生物试剂厂产品),DL2,000 DNA M aker(大连宝生物工程有限公司销售的Ta K a Ra产品),SYBR G reen I(美国应用生物系统公司产品)。
研究对象
经医院伦理委员会批准,征得患儿家属/法定监护人知情同意下获取ALL患儿的骨髓标本。并经FAB 分型及免疫分型确诊后才留取第1次标本,并定为第0天骨髓。共9例患儿,其中男6例,女3例,年龄2岁
4月至12岁,中位年龄9岁;9例患儿免疫分型均为B系ALL,按GZ-BF M2002ALL方案[1]进行化疗,于诱导化疗结束时,即化疗第33天收集第2次标本。每次收集4-6m l骨髓,置4e冰箱保存备用。
单个核细胞的分离及DNA的提取
应用淋巴细胞分离液分离出骨髓中单个核细胞,并按Q iagen DNA提取试剂盒的说明书提取单个核细胞中的DNA。
PCR反应
取上述提取的DNA2L l作为模板,以B I OM E D-1, B I OM ED-2研究[2]中已标准化的引物进行PCR反应,30L l反应体系包括:H2O(nuc l e a-free w ater):21.2L,l10@buffer:3L,l M gC l2:1.8L,l10 mm pl/L d NTPs:0.6L,l Am pli T aq GOLD:0.2L,l 15L m pl/L Pri m er1:0.6L,l15L m pl/L Pri m er* 2:0.6L,l Te m p late DNA:2L l。PCR反应条件: 94e9分钟;94e1分钟,60e1分钟,72e1分钟,共35个循环,最后72e7分钟。不同的引物,所用退火的温度不同,其中B-ALL共18对引物,5个温度条件。T-ALL共8对引物,4个温度条件。
电泳、测序、序列比对、引物设计
PCR反应所得产物进行琼脂糖凝胶电泳,电泳中有阳性条带的PCR产物送上海英骏公司进行基因测序。
把测序结果与正常人类基因组Ig/TCR基因DNA(NCB I BLAST中查找)进行对比,发现异常区域,根据病人异常的突变区域(Ig/TCR基因重排)设计病人特异性上游引物,并预订引物。
RQ-PCR对MRD的追踪研究
考试作文600字实时荧光定量PCR的反应体系25L l体系中包括有SYBR G reen I:12.5L;l Fo r w ard Pri m er*: 0.75L;l Rev er Pri m er*:0.75L;l Te m p late DNA: 2L;l H2O(nuc l e a-free w ater):9L l。实时荧光定量PCR的反应条件:95e10分钟;95e15秒,60e 1分钟,共50个循环,其中上下游引物因患儿的基因重排不同而变化。我们根据患儿的Ig/TCR基因重排设计上游引物,下游引物参照B I O M ED-1, B I O M ED-2的研究成果[2]。
标准曲线的构建及定量取第0天骨髓DNA1L,l 将其加入9L l水中,混匀后配制成浓度为10-1模板DNA,再从该稀释液中吸取1L l加入9L l水中,混匀后配制成10-2模板DNA,依次稀释至10-4,用作RQ-PCR的参比模板,各取未稀释的DNA和稀释后的模板DNA2L l加入反应体系中,平行做2次以验证重复性和提高准确性。将第33天骨髓DNA 与第0天骨髓DNA的含量进行对比,经校正按需加入相应量进入反应体系,经PCR反应后AB I实时荧光定量PCR仪自动绘制标准曲线,熔解曲线,并根据标准曲线自动定量。
结果
PCR产物电泳结果
PCR扩增后表现为Ig/TCR基因重排阳性产物,经琼脂糖凝胶电泳分离,以Ta K a Ra DL2,000DNA M aker为参照,先在紫外分光仪上观察电泳结果,然
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后在凝胶图像分析系统中拍照存盘,下图为PCR产物的电泳结果,其中标本3中H5、H6两对引物扩增的PCR产物有阳性条带(图1)。
F igure1.Electrophores is pa ttern of H5and H6 a m plified by PCR on agaro ge l(ca3).
基因测序结果
把电泳后有阳性条带的PCR产物送英骏公司测序,得出测序结果(图2)。
F igure2.Sequenci ng result of ca1.
测序结果的碱基序列GCATTAGCAGTTATTTAAATTGGTATCGGCAGA AACCAGGGAAAGTTCCTAAGCTCCTGATCTATA GTGCATCCAATTTGCAATCTGGAGTCCCATCTC GGTTCAGTGGCAGTGGATCTGGGACAGATTTCA CTCTCACTATCAGCAGCCTGCAGCCTGAAGATG TTGCAACTTATTACGGTCAACGGACTTACAATG CCCTCCCAGCCCTAGTGGCAGCCCAGGGCGAC TCCTCATGAGTCTGCAGCTGCATTTTTGCCATA TCCACTATTTGGAGTCTGACCTCCCTAGGAAGC CTCCCTGCTCCCTAGGACAACCTGCTCTGACCT CTGAGGACCTGTCTGTAAACGTCCAGAGAAAA GCATGTGCCTGAAGGGTCTA。基因重排结果
在NCB I BLAST中把测序结果与人类Ig/TCR基因序列进行比较,找出特异的重排序列,下表为9例病人的I g/TCR基因重排结果及测序的碱基数(附表)。
T able.Ig and TCR gene rearrange m ents o f9patien ts w ith B-ALL
NO of
patient
Ig
rearrange m ents
TCR
rearrange m en ts
S equenci ng
(bas e
num ber) 1V kappa1/Kd e N egative381
2VH1/J h conc D d elt a2/J delta1348
3V kappa3/Kd e N egative422 VH5/J h conc305 4Negati ve N egative
5VH3/J h conc N egative451
6Negati ve V ga mm a2/J ga mm a1326
7V kappa3/Kd e424
8VH2/J h conc369
9VH5/J h conc311
施莱尔马赫Ig:i m m unoglobu li n;TCR:T-ce ll recep t o r gene.
上游引物设计根据基因重排用Pr i m er Express 3.0软件设计病人特异性上游引物,设计好的引物在NCB I BLA ST中检索以确认引物的特异性,并向上海英骏公司预定引物。
实时荧光定量PCR结果
实时荧光定量PCR扩增图取患儿第0天骨髓DNA10倍倍比稀释,依次稀释至10-1、10-2、10-3、10-4,用作RQ-PCR的参比模板,AB I7000自动绘制标准的扩增曲线,其中X轴为循环次数,Y轴为荧光值(图3)。
F igure3.Am plification curves of the RQ-PCR assay.F luo re scence inten sity i n log arith m ic sca le
p l o tted aga i n st cyc le nu m ber,A n Ig rearrang e m ent w as ana l y zed(i n dupli cate)usi ng ria l dil uti on o f diagno stic spec i m en(100t o 10-4)(ca 2).
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应用实时荧光定量PCR技术检测儿童急性淋巴细胞白血病微小残留病
标准曲线构建AB I7000自动绘制标准曲线,曲线的相关系数为0.99,结果可信(图4)。
F igure4.Standa rd curve constructed fro m t he RQ-PCR.C ro ssi ng po i nts o f log li ne are p l o tted ag a i nst l o g co ncentrati on o f t he standard DN A t o generate a standard curve,and t he curv e s how s a sl o pe of-3.74and a co rrela tion co eff i c i ent o f0.99,bo t h be i ng i n the acceptab le range.
熔解曲线从熔解曲线可以看出特异的扩增样本在均在84e时有一高峰出现,无非特异性产物和引物二聚体出现,证实了PCR产物的特异性(图5)。
F igure5.M e lting c urves fro m am plification o f standa rd.Characteristi c m e lti ng peaks are(Tm=84e) o bta i ned from standards w it h copy nu m ber s of100to10-4. MRD值的动态研究
共9例患儿,1例患儿找不到特异的I g/TCR基因重排,2例患儿于诊断后放弃治疗,2例患儿因初始获得的DNA量过少而无法进行后续的定量,4例患儿成功地进行了定量分析。AB I7000自动得出第33天骨髓DNA中M RD的量,其M RD的值分别为2.74@10-4,7.5@10-4,阴性和4.2@10-2。
讨论
荷兰的一项对婴儿白血病M RD的研究发现:MRD 标危和中危组复发率为13%和31%,而M RD高危组全部复发[3]。D ana-Farber C ancer Institute (DFC I)对284例急性B淋巴细胞白血病患儿M RD 的水平进行前瞻性研究,发现诱导化疗后M RD阴性患儿5年复发的风险为5%,M RD阳性的患儿5年的复发风险为44%[4]。上海儿童医学中心的研究表明,MRD水平<10-4的患儿,其39个月的EFS为(83.00?9.90)%,而M RD水平较高的病人其EFS几乎为零。作者进一步进行单变量分析M RD水平与目前评价白血病的生物学因素(年龄、性别、白细胞数、细胞遗传学)之间的关系,结果证实M RD水平与这些因素无关,因此它可作为一个独立的预后因素[6]。A I EOP-BF M ALL2000的研究也表明,对于高危(HR)病人,M RD对预后的影响与以上几个生物学因素相似,但对于标危(SR)病人,M RD对预后的影响更为精确[5]。在I-BF M-SG M RD study91的研究中,根据MRD水平进行分型的结果,其EFS的结果
分别为标危组(M RD-SR) 93%,中危组(MRD-I R)74%,高危组(M RD-HR) 16%[7]。以上国内外的最新研究均表明,M RD的水平与儿童ALL的复发和预后密切相关。就国内而言,目前尚无检测M RD公认的方法,对M RD的研究还不太深入。本实验用RQ-PCR方法检测ALL M RD,并研究其在白血病临床诊断和治疗中的作用。
国内外常用检测M RD的方法为流式细胞仪检测技术及以PCR为基础的技术。目前应用最广泛的检测ALL M RD的实验技术是实时定量PCR (RQ-PCR)检测免疫球蛋白基因(Ig)和TCR基因重排[8,9]。RQ-PCR方法主要应用两种荧光基团,一种为荧光探针,一种为荧光染料。目前,实时荧光定量PCR扩增大多应用荧光标记探针的方法,有报道称[10]也可应用荧光染料法对M RD进行准确定量,并利用熔解曲线对PCR产物的特异性进行鉴定,与荧光探针相比,SYBR G reen I荧光染料法具有操作过程简单、费用低廉的优点,使其更容易常规应用而不是限于实验室研究;结合熔解曲线,并对引物及PCR条件进行优化,SYBR G reen I荧光染料法可作为一种检测M RD的方法。
本研究是运用普通PCR的方法结合基因测序检测Ig/TCR基因重排,并根据重排设计特异性引物,然后用SYBR G reen I荧光染料实时荧光定量PCR的方法对M RD水平进行追踪。共检测9例患儿,免疫分型均为B-ALL,除4号患儿未发现重排外,其余8例患儿能够发现I g/TCR基因重排,总的Ig/TCR重排率为88.8%,其中2号患儿和3号患儿发现有2个基因重排,这与I BF M协作组的报道
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相似[7],根据本研究结果提示,中国人与欧洲人的Ig/TCR基因重排相似,我们的研究可以利用B I OM ED-1,B I OM ED-2已标准化的引物和方法。
完成任务英语根据4例患儿的Ig/TCR基因重排序列设计特异性上游引物,对诱导化疗后(第33天)骨髓MRD 水平进行检测,发现其M RD水平下降,其中1例检测为阴性。追踪结果表明,第33天M RD水平较低的患儿临床分型为标危病人,第33天M RD值为4.2@10-2的病人在维持治疗过程中复发。本实验对骨髓标本的量要求较多,标本太少提取的DNA 也少,在以后的实验中因为不够用而不能发现重排标记,后续的实验就无法进行,本实验有2例病人也因留取的骨髓标本太少不能完成实验,所以尽管在临床上操作有一定的困难,还是要尽量的多留取标本。
本实验需加大追踪病例数,延长追踪时间,以研究和证实M RD与ALL的关系,并根据M RD的水平指导白血病的诊断和治疗。
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