doi:10.3969/j.issn.1006-9852.2021.01.006
•论 著•趋化因子CXCL10作为神经病理性疼痛
生物标记物的研究*
邓雨涛1 程祝强2 高永静1△ 姜保春1△
（1南通大学疼痛医学研究院，特种医学研究院，南通226019；2东部战区总医院疼痛科，南京 210002）
摘要目的：目前临床上缺乏神经病理性疼痛诊断和预后判断的客观指标，本研究旨在检测神经病理性疼痛小鼠和人的脑脊液 (cerebrospinal fluid, CSF) 和血清中趋化因子CXCL10的表达情况。方法：结扎ICR小鼠L5脊神经 (spinal nerve ligation, SNL) 构建神经病理性疼痛 (neuropathic pain, NP) 模型，足底注射福尔马林或完全弗氏佐剂 (complete Freund's adjuvant, CFA) 建立炎症性疼痛模型；收集捐献者的脑脊液和血液，采用Real-time PCR、半定量PCR、Western Blot、免疫荧光和ELISA方法，分别检测CXCL10和CXCR3的mRNA和蛋白表达、CSF和血清中CXCL10的表达。结果：①Cxcl10在正常ICR小鼠的脾脏、淋巴结、背根神经节 (dorsal root ganglion, DRG)、脊髓和脑中有不同程度的基础表达；②Cxcr3在正常ICR小鼠的脾脏、淋巴结、DRG、脊髓和脑中也有不同程度的基础表达；③与假手术组相泡面是谁发明的
比，SNL模型小鼠CSF与血清中CXCL10含量显著增加(P < 0.05, P < 0.01)；急性炎症性疼痛小鼠CSF和血清中CXCL10与对照组相比无显著变化；慢性炎症性疼痛小鼠CSF中CXCL10与对照组相比无显著变化；血清中CXCL10显著增加(P < 0.05)；④健康人类受试者的脊髓、DRG和淋巴结中有CXCL10和CXCR3表达；⑤疱疹后神经痛病人CSF与血清中CXCL10与对照组相比显著增加(P < 0.05)，骨性关节炎病人CSF和血清中CXCL10无显著增加。结论：神经病理性小鼠CSF和血清以及疱疹后神经痛病人CSF和血清中CXCL10表达显著增加，CXCL10可能作为神经病理性疼痛的生物标志物。
关键词神经病理性疼痛；脑脊液；血清；趋化因子；CXCL10
A study of chemokine CXCL10 as a biomarker of neuropathic pain *
DENG Y u-Tao1, CHENG Zhu-Qiang2, GAO Yong-Jing1△, JIANG Bao-Chun1△
(1 Institute of Pain Medicine and Special Environmental Medicine, Nantong University, Nantong 226019, China;
2 Department of Pain Medicine, Nanjing Jinling Hospital, Nanjing 210002, China)
Abstract Objective: The objective biomarkers for the diagnosis and prognosis of neuropathic pain are still lacking. The aim of this study was to determine CXCL10 levels in the rum and cerebrospinal fl
uid (CSF) in mice and human and to evaluate whether CXCL10 can be ud as a biomarker in neuropathic pain. Methods: The neuropathic pain (NP) was established by L5 spinal nerve ligation (SNL) of ICR mice. Inflammatory pain was induced by injection of formalin or complete Freund's adjuvant (CFA) in the hind paw. The mRNA expres-sion of CXCL10 and CXCR3 in distinct tissues was assd by real-time PCR (RT-PCR) and mi-quantitative PCR, and the protein expression was detected by immunofluorescence or western blotting (WB). CXCL10 levels in the rum and CSF were tested by ELISA. Results: ①Cxcl10 is expresd at different levels in spleen, lymph nodes, dorsal root ganglion (DRG), spinal cord, and brain of adult ICR mice; ②Cxcr3 is expresd at differ-ent levels in spleen, lymph nodes, DRG, spinal cord, and brain of adult ICR mice; ③Compared with the sham group, the CXCL10 content in the CSF and rum of SNL mice was significantly incread (P < 0.05, P < 0.01);
CXCL10 in CSF and rum of mice with acute inflammatory pain had no significant change compared with that
*基金项目：国家自然科学基金（31671091, 31871064, 81771197, 81971054）；江苏省自然科学基金（BK20171255）；江苏省高校青蓝工程；江苏省六大人才高峰（SWYY-070）
△通讯作者姜保春jiangbaochun@ntu.edu；高永静gaoyongjing@ntu.edu
疼痛是继体温、呼吸、脉搏和血压之后的第五大生命指征，其特殊之处在于目前没有客观的生物仪器进行检测，疼痛程度的评估主要依赖病人的主观感受，临床上也缺少疼痛诊断、预后和治疗有效性判断的生物标志物。慢性疼痛是指持续或反复发作超过3个月的疼痛，其中由躯体感觉神经系统损伤或疾病引起的神经病理性疼痛 (neuropathic pain, NP) 是临床常见的慢性疼痛[1]。长期的慢性疼痛会导致病人无法正常工作、睡眠和饮食等，严重影响病人的身心健康、社会关系和生活质量，给家庭和社会带来沉重的负担[2]。目前针对慢性疼痛尤其是NP的治疗，临床上缺乏有效的治疗药物和检验指标，因此亟需对慢性疼痛的发病机制和客观反映疼痛情况的生物标志物进行研究。
理想的疼痛诊疗生物标记物应能够准确反应疼痛程度和进展情况，并能预测由急性向慢性转化的风险等级，测量过程中应满足容易、快速、廉价和可重复等条件。血浆和脑脊液被认为是生物标志物研究的理想选择，血浆中的前列腺素 E2 (prostaglan-din E2, PGE2)、神经生长因子 (nerve growth factor, NGF)和白细胞介素2，以及脑脊液 (cerebrospinal fluid, CSF) 中的胶质细胞源性神经营养因子 (glial cell line-derived neurotrophic factor, GDNF)、P物质(substance P, SP) 等被证明与不同类型疼痛的发生发展相关[3]。遗传类生物标记物则主要围绕离子通道、G蛋白偶联受体和药物代谢等基因的单核苷酸多态性进行 (single nucleotide polymorphisms, SNPs) 研究[3]。遗憾的是，现阶段关于疼痛标记物的研究尚处于起步阶段，虽发现了一些潜在的生物标记物，但其临床有效性和应用范围需作进一步研究，且仍需筛选并确定新的理想标记物。
曼德海峡
大量的动物实验证明慢性疼痛常伴随着外周和中枢的组织损伤和炎症。外周组织、背根神经节(DRG)、脊髓和脑中的趋化因子在慢性疼痛的发生和维持中发挥了重要作用[1]。趋化因子是一类分泌型的细胞因子或信号蛋白，由50多个成员组成。趋化因子通过形成可溶性或固定的浓度梯度调控免疫细胞由低浓度向高浓度迁移[1]。神经损伤或组织损伤后，趋化因子不仅从浸润的免疫细胞和胶质细胞中表达上调、释放、导致外周敏化，而且中枢神经系统中的神经元、小胶质细胞和星形胶质细胞也能够合成并释放趋化因子，通过敏化感觉神经元，进一步增强胶质激活和神经炎症等导致中枢敏化[4]。趋化因子在导致外周敏化和中枢敏化的同时，还可分泌进入血液和脑脊液，或可作为慢性疼痛的生物标志物[5,6]。
CXCL10 (C-X-C motif chemokine 10) 属于CXC 型趋化因子配体，通过与CXCR3受体结合发挥作用。CXCL10和CXCR3能够在外周和中枢神经系统中表达[7,8]，参与脱髓鞘神经病变、神经炎症和多发性硬化症等神经系统功能异常和疾病的调控[7,9,10]。CXCL10/CXCR3信号在外周和脊髓中参与慢性疼痛和慢性瘙痒的调控[11,12]。本实验室前期研究发现在脊神经结扎 (spinal nerve ligation, SNL) 诱导的NP 模型中CXCL10在脊髓背角神经元和星形胶质细胞中表达增加，通过与CXCR3结合介导星形胶质细胞和神经元的相互作用促进NP [11]。而且鞘内注射CXCL10诱导小鼠痛觉过敏[13]，表明CXCL10在脊髓的表达与NP存在密切关系。但在急性和慢性疼痛条件下，CXCL10在小鼠和病人的脑脊液和血液的表达水平变化还未见报道。
本研究采用小鼠L5脊神经结扎模型及慢性炎症疼痛模型，观察比较了不同疼痛模型小鼠CSF与血清中CXCL10的表达变化，并首次检测了急性带状疱疹、带状疱疹后神经痛和慢性关节炎病人血清和CSF中CXCL10的含量，探讨其作为NP临床诊断指标的可能性。
方 法
1.材料
动物：健康成年雄性ICR小鼠，由南通大学动物实验中心提供。人的脊髓、DRG和淋巴结组织
of control group; Compared with the control group, the rum CXCL10 of mice with chronic inflammatory pain was significantly incread (P < 0.05), but there was no change in CSF; ④The expression of CXCL10 and CXCR3 was obrved in DRG, spinal cord and lymph node of healthy subjects; ⑤The levels of CXCL10 in CSF and rum were elevated in patients with postherpetic pain (P < 0.05), but not in patients with osteoarthri-tis. Conclusion: Our results indicated that the CXCL10 content was significantly incread in rum or CSF of both mou and human experiencing neuropathic pain. Thus, CXCL10 may rve as a possible objective diag-nostic and/or prognostic marker of neuropathic pain.
Key words Neuropathic pain; Cerebrospinal fluid; Serum; Chemokine; CXCL10
由美国National Dia Rearch Interchange (NDRI) 和南通大学附属医院病理科提供。脑脊液和血液样品由东部战区总医院疼痛科收集提供。
试剂和药品：CXCL10抗体 (Goat, R&D Systems, AF-466-NA)；CXCR3抗体(Rabbit, 博士德生物，PB0038)；荧光二抗，Cy3-donkey anti-goat IgG、Cy3-donkey anti-rabbit IgG和Alex-488-donkey anti-mou (Jackson)；近红外荧光基团标记二抗IRDye 800CW goat anti-rabbit IgG（美国LICOR Odysy）；RIPA 组织裂解液 (Beyotime)；BCA蛋白浓度测定试剂盒(Thermal Scientific)；人和小鼠CXCL10 ELISA试剂盒，Human CXCL10/IP-10 Quantikine ELISA Kit、Mou CXCL10/IP-10/CRG-2 DuoSet ELISA (R&D Systems)；逆转录试剂盒（南京诺唯赞）；其余化学试剂由美国Sigma公司提供。
实验所用主要仪器：荧光定量PCR仪 StepO-nePlus (Applied Biosystems)；普通PCR仪 (Applied Biosystems)；电泳仪(Bio-Rad Laboratories)；倒置激光共聚焦显微镜SP8 (Leica)；Odysy双色红外荧光扫描仪（美国LI-COR）；多功能酶标仪（美国BioTek）；冰冻切片机 (Thermo Scientific)；高速冷冻离心机 (Eppendorf)。
2.方法
（1）疼痛模型建立
神经病理性疼痛模型的建立：将健康成年ICR 小鼠随机分为正常组 (Naive)，假手术组 (Sham)和模型组 (SNL)。SNL组小鼠禁食禁水8 h，使用异氟烷吸入麻醉剃除小鼠背部毛发后用碘伏消毒，在其背部距髂脊1 cm处切开皮肤，延腰背部正中线外白线处纵向分离肌肉，钳断L6腰椎横突使L5脊神经暴露并分离，使用6-0丝线结扎。之后缝合肌肉、筋膜和皮肤，置于温暖环境中苏醒。Sham组动物的手术过程同SNL组，但不结扎L5脊神经。
急性疼痛模型建立：小鼠分为Naive组和急性疼痛组 (Formalin)。在清醒状态下，向小鼠左侧足底皮内注射5% Formalin 20 μl制备急性炎症性疼痛模型。
慢性炎症性疼痛模型建立：动物分为Naive组和慢性炎症性疼痛模型组 (CFA)。向小鼠左侧足底皮内注射50% CFA 20 μl制备慢性炎症性疼痛模型。
Naive组小鼠不作任何处理。
（2）RT-PCR和mi-quantitative PCR
组织中的总RNA提取：小鼠吸入异氟烷麻醉后，用生理盐水灌流后取脾脏、淋巴结、脊髓、脑和DRG。用Trizol提取RNA。用 OD 仪测量 RNA 浓度与纯度，OD260/280在 1.8-2.0且 OD260/230大于2为宜。
每个样本取1 μg总RNA逆转录为cDNA。引物由生工或Invitrogen（上海）合成，具体引物序列见表1。
半定量RT-PCR及琼脂糖凝胶电泳：半定量RT-PCR实验所采用的样本、反应体系及引物与Real-time PCR一致，但反应循环数不同：比较小鼠CXCL10在脾脏、淋巴结、脊髓、脑和DRG中的表达含量采用的Ct值为30；比较小鼠CXCR3在脾脏脏、淋巴结、脊髓、脑和DRG中的表达含量采用的Ct值为35。然后对PCR产物进行琼脂糖电泳。
人的脊髓、DRG和淋巴结组织RNA提取和PCR方法与小鼠一致，具体引物序列见表1。
（3）免疫荧光
表1 小鼠Cxcl10、Cxcr3和内参β-actin引物序列
Table 1 Primer ts for the human and mou Cxcl10, Cxcr3, β-actin and Gapdh
基因Gene引物序列Primer Sequence长度Size
Mou Cxcl105'-TGAATCCGGAATCTAAGACCATCAA -3'
信行禅师碑171 bp 5'-AGGACTAGCCATCCACTGGGTAAAG -3'
Mou Cxcr35'-TACCTTGAGGTTAGTGAACGTCA-3'
100 bp 5'-CGCTCTCGTTTTCCCCATAATC-3'
Mou β-actin 5'-CATCCGTAAAGACCTCTATGCCAAC-3'
171 bp 5'-ATGGAGCCACCGATCCACA-3'
Human Cxcl105'-GTGGCATTCAAGGAGTACCTC-3'
198 bp 5'-TGATGGCCTTCGATTCTGGATT-3'
Human Cxcr35'-CCACCTAGCTGTAGCAGACAC-3'
141 bp 5'-AGGGCTCCTGCGTAGAAGTT-3'
Human Gapdh 5'-AGCCACATCGCTCAGACAC-3'
66 bp 5'-GCCCAATACGACCAA ATCC-3'
小鼠经异氟烷吸入麻醉后，经生理盐水和4%多聚甲醛灌注固定。取小鼠脾脏和腘窝淋巴结，4%多聚甲醛后固定过夜，蔗糖脱水后切片，厚度为14 μm。
朦胧的什么
免疫荧光染色：PBS (0.01 M，pH值7.4)洗片；加5%羊血清室温封闭2 h后加一抗(CXCL10, 1:100; CXCR3, 1:200)，4℃过夜后经PBS漂洗加入Cy3标记的荧光二抗(1:1000, Jackson ImmunoRearch)；室温孵育2 h。晾干后封片，激光共聚焦显微镜下拍照观察。
（4）Western Blot分析
组织蛋白质提取：小鼠经异氟烷麻醉，生理盐水经心脏灌流后取材，用RIPA 蛋白裂解液提取蛋白。用BCA法测定蛋白浓度。每孔加入30 μg蛋白进行电泳，湿法转膜将蛋白转移到PVDF膜上；5% BSA室温封闭2 h，4℃一抗过夜孵育(CXCR3, 1:1000; GAPDH, 1:1 0000)；次日室温复温1 h后TBST漂洗；用5% BSA稀释近红外荧光基团标记的二抗，室温孵育2 h；Odysy双色红外荧光扫描仪成像。
压岁礼浮的反义词人的脊髓和淋巴结组织CXCR3蛋白表达检测方法与小鼠相同。
（5）CSF样本及血清样本收集与处理
小鼠CSF收集与处理：4%水合氯醛腹腔注射麻醉小鼠，用脑立体定位仪对小鼠头部进行固定。剃毛后碘伏消毒后划开皮肤与肌肉，暴露环枕膜。用玻璃电极抽取CSF 25 μl，-80℃保存。
小鼠血液样本收集与处理：小鼠尾部采血：小鼠用异氟烷麻醉后将小鼠尾巴用75%酒精棉球反复擦拭，用剪刀剪去尾尖1～2 mm，用1.5 ml EP 管收集尾尖血液，采血后用棉球压迫止血每次采血100 μl。
将新鲜血液放入SST血清分离管中，室温下放置30 min，待血细胞凝集后，离心吸取血清，冻于-80冰箱存放。
人脑脊液CSF和血液样本的收集与处理：收集非疼痛病人（Control，无急慢性疼痛病史、无炎症性疾病）、急性带状疱疹神经痛 (herpes zoster neuralgia, HZN)、带状疱疹后神经痛 (postherpetic neuralgia, PHN)和骨性关节炎 (osteoarthritis, OA) 疼痛病人的血液和脑脊液。本研究经东部战区总医院伦理委员会批准，所有病人均签署知情同意书。用腰椎穿刺法采集各组病人脑脊液 1 ml -80℃冰箱冻存。将5 ml新鲜血液放入SST血清分离管中，室温下放置30 min，待血细胞凝集后，离心吸取血清-80℃冰箱冻存。提供脑脊液样本和血液样本的病人的数量、性别、年龄、病程和视觉模拟评分法 (vi-sual analogue scale, V AS)评分数据见表2、3。5岁小孩身高体重标准
（6）ELISA
样品制备：用RIPA裂解液提取人淋巴结和脊髓组织蛋白，具体方法与Western Blot实验一致，提取后的蛋白上清用Calibrator Diluent RD5K进行10倍稀释：10 μl 蛋白上清 + 90 μl Calibrator Diluent RD5K。血清和CSF样本根据说明书要求进行稀释。
根据试剂盒说明进行操作，每孔加入75 μl Cal-ibrator Diluent RD5K稀释后的蛋白样品。经加样、富集孵育、洗板、加酶标抗体、再次洗板、底物显色和终止反应步骤后酶标仪读取450 nm下样本的OD值。
表2脑脊液捐献者的基本信息(x±SEM)
Table 2The general information of CSF donor (x±SEM)
组别Group
例数
Number
性别Gender
女/男(F/M)
年龄
Age
疼痛持续时间
Pain duration
视觉模拟评分法
V AS
Control81F/7M55.0±5.100 HZN (< 1 m)64F/2M63.0±2.921.2±3.5 d 5.3±0.6 PHN (> 1 m)157F/8M68.9±2.0 28.9±20.4 m 5.1±0.4 OA65F/1M66.0±2.115.9±0.6 m 3.8±0.6
表3血清捐献者的基本信息(x±SEM)
Table 3The general information of rum donor (x±SEM)
组别Group
例数
Number
性别Gender
女/男(F/M)
年龄
Age
疼痛持续时间
Pain duration
视觉模拟评分法
V AS
Control81F/7M55.0±5.100 HZN (< 1 m)95F/4M60.1±2.516.0±3.1 d 5.6±0.6 PHN (> 1 m)158F/7M68.8±2.2 25.5±20.5 m 5.5±0.4 OA65F/1M66.0±2.115.9±0.6 m 3.8±0.6
50 μm 50 μm
C
CXCL10
Spleen
Lymph node
Lymph Spleen node 100
DRG
Brain Spinal cord
Lymph node
Spleen 100
1501502002003000.3
18202224262830323436
一天英语0.91.52.12.73.33.94.55.1Cycles
F l u o r e s c e n c e
DRG cord Brain
Cxcl10, 171 bp
Cxcl10
β-Actin, 171 bp
Spinal
A
D
B
