农业生物技术学报，2010年，第18卷，第5期，第846~852页Journal of Agricultural Biotechnology,2010,Vol.18,No.5,846~852
DOI:10.3969/j.issn.1674-7968.2010.05.003基金项目：本研究由转基因重大专项(No.2008ZX08012-001)资助收稿日期：2009-10-28接受日期：2009-11-24
研究报告A Letter
转基因水稻DNA 样品浓度以及存放条件对PCR 定性检测的影响
王渭霞
赖凤香洪利英
傅强*
中国水稻研究所，杭州310006*通讯作者，
摘要通过在不同模板DNA 浓度（0.2~16ng/μL ）、不同转基因含量（0.05%~50%W/W ）以及不同模板存放
温度（22℃、4℃和－20℃）和存放时间（1、2、3周和1，3个月）条件下进行转基因水稻外源成分的定性PCR 检测，发现当模板浓度在0.4ng/μL 以上时所有引物均能扩增出目标片段，对于转基因含量为1.0%和0.1%的混合样品，能稳定检测出转基因成分所需的DNA 最低浓度分别为1和2~4ng/μL 。模板DNA 的不同温度存放条件对检测没有明显影响，长时间存放后PCR 扩增产物条带亮度有所减弱。关键词
转基因水稻,DNA 浓度,PCR，转基因检测
Effects of DNA Concentrations and Storage Conditions on PCR Detection of Transgenic Rice
Wang Weixia Lai Fengxiang Hong Liying Fu Qiang*
China National Rice Rearch Institute,Hangzhou 310006,China *Corresponding author, DOI:10.3969/j.issn.1674-7968.2010.05.003
Abstract The effects of DNA concentrations (0.2~16ng/μL),transgene contents (50.0%~0.05%,W/W),storage temperatures(22℃，4℃，－20℃)and storage periods (1，2，3weeks and 1,3months)on qualitative PCR detection of transgene from transgenic rice (Oryza sativa ssp.indica )were evaluated.The result showed that all the primers can amplified targeted fragment w
hen DNA concentration was higher than 0.4ng/μL.For mixed samples with 1.0%and 0.1%transgene,the lowest DNA concentration which was still detectable was 1ng/μL and 2~4ng/μL,respec-tively.Sample storage at the three tested different temperatures did not affect subquent PCR detection.And the brightness of electrophoresis strips of PCR products were gradually weakened after3months storage of DNA sample.Keywords
Transgenic rice,DNA concentration,PCR,Transgene detection
转基因植物及其产品的安全性已经引起了全球公众的担忧，转基因产品的检测已纳入国内外检验检疫部门的检测项目。目前依赖于PCR 的核酸检测技术是转基因生物检测的主要技术。但是，以下两个方面的因素对PCR 检测技术的灵敏度和特异性有不可忽视的影响。一个是获取可靠的分析所需要的模板DNA ，另一个是设计合适的PCR 引物（吕山花等，2002）。通常认为模板DNA 浓度、存放的温度和时间对PCR 扩增都有影响。已有研究表明，组织样本在不同条件下长期保存后对目标基因的扩增没有明显影
响，如动物病理样本中病毒DNA 的检测（Jerome et al.，2002），植物病原菌的PCR 检测（Li et al.,2008）。但是，尚未见直接以DNA 样本为对象，研究其不同存放温度、时间等条件对PCR 检测转基因的影响。本研究参考转基因植物检测标准和文献提供的引物序列(Randhawa et al.,2009；何龙飞
等,2007)，系统地对比分析了转基因水稻模板DNA 的量，以及转基因水稻不同含量混合样品的模板DNA 浓度和模板DNA 存放条件和时间对转基因检测的影响，以期建立准确、灵敏和有效的转基水稻成分检测技术体系。
转基因水稻DNA 样品浓度以及存放条件对PCR 定性检测的影响
Effects of DNA Concentrations and Storage Conditions on PCR Detection of Transgenic Rice
1结果与分析
1.1不同模板浓度对检测的影响
为了研究模板DNA 样品的浓度对利用PCR 检测外源基因结果的影响，设置了系列DNA 模板浓度梯度（0.2~16ng/μL ），以对应于检测目标片段的特异性引物进行了35个循环的PCR 检测。实验结果显示模板浓度在1ng/μL 以上时，所有引物均能扩增出明显的目标片段，当模板浓度为0.4ng/μL 时Bt 和
Bar 引物扩增条带减弱，当模板浓度为0.2ng/μL 时，仅有NOS 165bp 有明显扩增条带，其余引物未得到明显扩增（图1）。
1.2不同含量的转基因样品对PCR 检测的影响
不同含量的转基因混合样品中目标分子的含量也不同，根据结果1选取终浓度为10.0、
5.0、3.2、1.6和1.0ng/μL 的转基因含量分别为1.00%，0.10%和0.05%的DNA 样品进行定性PCR 检测，结果显示
图1转基因水稻不同浓度DNA 的检测
M ：100bp DNA ladder ；1~8：分别为100%转基因水稻模板DNA 浓度16.0、10.0、5.0、3.2、1.6、1.0、0.4和0.2ng/μL ；9：阴性非转基因对照；10：提取空白对照；11：PCR 空白水对照
Figure 1PCR detection by different DNA concentrations of transgenic rice
M ：100bp DNA ladder ；1~8：100%transgenic rice with DNA concentrations 16.0,10.0,5.0,3.2,1.6,1.0,0.4and 0.2ng/μL,respectively ；9：Non-transgenic rice ；10：Extract blank control ；11：PCR blank H 2O control
NOS 165bp
NOS 180bp
NOS 118bp
CaMV35S 165bp
Bar 175bp
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500700300200100
bp 5001000300200100
如何查询手机流量bp 15001000500300100
bp 2001000500300100
bp 5001500400200
bp 15001000500300
800bp 5001000300200100
bp 1000847
农业生物技术学报
Journal of Agricultural Biotechnology
DNA 浓度为1.6ng/μL 以上时，除CpTi 外，其余基因都能从含量为0.05%的混合样品中检出。当浓度为 1.0ng/μL 时检测结果重复性不好，其中CaMV35S ，CpTi 和Bt 在转基因含量为0.1%的样品中未扩增出明显的目标条带。而DNA 浓度为1.0ng/μL 时，含量0.05%的转基因水稻混合样品中hpt 和bar 基因能够检出（图2）。对于转基因成分含量低于1.0%的样品模板，
DNA 浓度在1.6~10.0ng/μL 的范围内所扩增目标片段的亮度基本一致。1.3不同存放条件和存放时间对检测的影响
一般认为DNA 长时间存放会发生降解，从而影
响到PCR 检测。实验选取转基因含量分别为50.0%、1.0%和0.1%，浓度均为125.0ng/μL 的模板DNA （PCR 反应体系终浓度为5.0ng/μL ）若干份，各样品分别存放在22℃、
4℃和－20℃，存放1、2、3周和1，3个月后进行PCR 检测目标转基因。结果发现不同存放温度对定性PCR 检测结果无明显影响，长时间存
放后PCR 扩增条带有所减弱
（图3）。2讨论
DNA 模板浓度是影响PCR 扩增结果的重要因子之一，浓度太高或太低对PCR 扩增结果都有影响，只有在适宜的浓度范围内才能扩增出理想的结
果。通常，PCR 检测对模板DNA 浓度的要求范围很广（0.1~2.0μg ），适宜的模板DNA 浓度约为30~50ng ，不到1ng 的基因组DNA 序列就足以用来进行PCR
分析，甚至1个DNA 分子就能扩增出特定的DNA 序列。在转基因水稻检测的相关标准中一般规定的
DNA 模板浓度下限为1ng/μL 。本研究发现，
能稳定图2不同含量的转基因水稻在不同DNA 浓度下的PCR 检测
M ：100bp DNA ladder ；1~5：转基因水稻含量1.0%（WW ）模板DNA 浓度依次为10.0、5.0、3.2、1.6和1.0ng/μL ；6~10：转基因水稻含量0.1%（W/W ）模板DNA ，浓度依次同上；11~15：转基因水稻含量0.05%（W/W ）模板DNA ，浓度依次同上；16：含量50%的阳性转基因水稻对照；17：阴性非转基因水稻对照；18：提取空白对照；19：PCR 空白水对照。Figure 2PCR detection with different contents of transgenic rice and different DNA concentrations
M ：100bp DNA ladder ；1~5：Transgenic rice with 1.0%(W/W)content with DNA concentration 10、5、3.2、1.6、1.0ng/μL,respectively ；
6~10：Transgenic rice with 0.1%(W/W)content with DNA concentration same as above ；11~15：Transgenic rice with 0.05%(W/W)content with DNA concentration same as above ；16：Transgenic rice with 50%content with DNA concentration 2ng/μL ；17：Non transgenic rice ；18：Extract blank control ；19：PCR blank H 2O control
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c盘怎么清理5
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检测出含1.0%以上转基因模板目标基因的最低浓度为1ng/μL 。对于转基因含量低于1.0%的混合样
品，模板DNA 浓度在1ng/μL 时重复性不强，
会出现假阴性的扩增结果，为了保证有效的扩增效率，有
必要提高模板浓度含量至2~4ng/μL 。实验发现转基
因含量为0.05%~0.10%的样品DNA 浓度在1.6~10.0ng/μL 的范围内时，所扩增目标片段的亮度基本一致，扩增目标片段并没有因为模板浓度的增
图3不同存放条件和时间下转基因水稻DNA 的PCR 检测结果M ：100bp DNA ladder ；1~4：转基因水稻含量为50%(W/W)的模板DNA ，分别存放在22℃、4℃、－20℃（冻融2或6次）、；5~8：转基因水稻含量为1.0%(W/W)的模板DNA ，存放条件同上；9~12：转基因水稻含量0.1%(W/W)的模板DNA ，存放条件同上；13~16：非转基因水稻模板DNA ，存放条件同上；17：提取空白对照18：PCR 空白水对照Figure 3PCR detection of transgenic rice DNA stored at different conditions and periods M ：100bp DNA ladder ；1~4：DNA with 50%(W/W)transgenic rice content ，stored at 22℃,4℃,－20℃(freeze-thaw twice or six
times)and －20℃(freeze-thaw once),respectively ；
5~8：DNA with 1.0%(W/W)transgenic rice content stored condition same as above ；9~12：DNA with 0.1%(W/W)transgenic rice content ，stored condition same as above ；13~16：Non-transgenic
rice DNA ，stored condition same as above ；17：Extract blank control ；18：PCR blank H 2O control
转基因水稻DNA 样品浓度以及存放条件对PCR 定性检测的影响
Effects of DNA Concentrations and Storage Conditions on PCR Detection of Transgenic Rice
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CaMV35S 195bp HPT 839bp Bt 301bp CpTi 415bp Bar 175bp NOS 180bp
存放1周One week storage
存放3个月Three month storage
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湖南文理学院芙蓉学院17竹开头的成语
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加而变亮，这可能与模板DNA的复杂度和纯度有关。而对于一些DNA含量很低的深加工产品的转基因检测，可供利用的有效模板可能会远远低于其通过紫外分光光度计测定的DNA模板量。如黄昆仑等（2003）用巢式和半巢式PCR检测转基因大豆的深加工产品时，将模板浓度提升到10ng/μL时才得到有效检测结果。本研究还发现在相同扩增条件下，不同引物检测灵敏度存在差异，尤其是在检测低含
量转基因样品时。其中检测CpTi基因的引物灵敏度最低，很难有效的扩增出转基因含量0.1%的混合样品，而检测hpt基因的引物能有效检出转基因含量0.05%~0.10%的混合样品。推测与引物GC含量有关，CpTi引物共计46个碱基G+C只有17个，占36.9%。HPT引物共计36个碱基G＋C共19个，占52.8%。
在PCR检测中一般要求将模板DNA保存在－20℃或－80℃条件下，且避免反复冻融。对于需要经常使用的DNA需要分装和多管存放，需要使用时取出，融化后应该立即使用，使用结束后，剩余的DNA 应在4℃冰箱短期保存，存放时间不宜超过14d （张文玲，2009）。在大批量多参数的转基因检测和复核检查中，样品DNA的存放时间一般都会在1个月左右，本实验通过对比不同存放条件发现，4种不同温度存放条件对转基因目标片段的扩增检测没有明显影响，而长时间的存放（3个月）对目标片段的扩增亮度有影响，扩增条带有所减弱，这可能与原始DNA模板的部分降解有关。但如果起始模板浓度高（125ng/μL），即使DNA发生部分降解，也不影响定性PCR检测结果的判断。同时DNA在长期存放中降解的速率也与DNA的纯度即质量有关，高纯度的DNA样品减少了其他杂质的抑制和对DNA样品稳定性的影响，在长期存放后仍能扩增出目标片段。根据本研究结果建议在转基因成分检测中要长时间保存已提取的DNA时，应该尽量保证样品DNA的高纯度和合适的DNA浓度。另外，注意引物设计为扩增较小的基因片段。
3材料与方法
3.1材料
转基因水稻(Oryza Sativa ssp indica)材料KF6（中国科学院遗传与发育研究所和福建省农业科学院研发，含有目的基因cry1Ac和CpTi，筛选标记基因hpt，CaMV35S启动子，NOS终止子）和中99-1（中国水稻研究所研发，含有目的基因bar、CaMV35S 启动子，NOS终止子），非转基因水稻对照明恢86。
3.2方法
3.2.1样品的混合
分别将转基因水稻KF6和中99-1按0.05%、0.1%、1.0%和50.0%不同重量比例(W／W)与非转基
因水稻明恢86混合后，磨成粉末，制成转基因水稻含量分别为0、0.05%、0.1%、1.0%和50.0%的样品。
3.2.2DNA的提取
根据农业部953号公告-6-2007提取含有转基因成分分别为0、0.05%、0.1%、1.0%和50.0%(W/W)的混合样品的DNA，同时用双蒸水设置提取空白对照。3.2.3DNA的稀释和存放
将各样品DNA用分光光度计定量后，用ddH
2
O 稀释到浓度为400、250、125、80、40、25、10和5 ng/μL。用于不同外源基因的定性PCR检测。将转基因含量为50.0%、1.0%和0.1%，阴性对照样品的DNA稀释到浓度125ng/μL，各分1管分别保存于22、4和－20℃等3种温度条件下，在1、2、3周和1、3个月等5个不同时间后反复用于检测。另将不同含量的混合样品在－20℃条件下各保存5管分别在1、
2、3周和1、3个月等5个不同时间后用于检测。
3.2.4转基因成分定性PCR检测
PCR定性扩增检测设置空白对照(ddH2O)，检测基因及所用引物见表1，扩增程序为95℃变性5 min，35个循环的94℃30s，58℃40s，72℃50s，72℃延伸3min。反应体系为10×PCR缓冲液（100 mmol/L Tris-HCl pH8.3，500mmol/L KCl，15mmol/L MgCl2）2.5μL，2.5mmol/L dNTP2.0μL，10μmol/L 引物各0.5μL，5U/μL Taq DNA聚合酶(大连宝生物公司)0.125μL，25μL反应体系中加模板DNA 1.0μL，则对应的DNA终浓度分别为16、10、5、3.2、1.6、1.0、0.4和0.2ng/μL。PCR反应结束后，产物8.0μL用2.0%琼脂糖凝胶电泳检测。
3.2.5不同浓度的模板DNA的定性PCR检测
所提样品DN A经浓度测定OD
260
/OD280为1.8~1.9之间，浓度介于600~400ng/μL。将转基因含
量为50.0%的转基因水稻模板DNA，用ddH
2
O稀释为8个浓度梯度，分别为400、250、125、80、40、25、10和5ng/μL，检测引物对应于NOS终止子、CaMV35S 启动子、筛选标记基因hpt、目的基因bar、CpTi和cry1Ac（表1）。
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