㊀南京农业大学学报㊀２０２１ꎬ４４(２):２４９－２５８ｈｔｔｐ://ｎａｕｘｂ.ｎｊａｕ.ｅｄｕ.ｃｎ㊀ＪｏｕｒｎａｌｏｆＮａｎｊｉｎｇＡｇｒｉｃｕｌｔｕｒａｌＵｎｉｖｅｒｓｉｔｙＤＯＩ:１０.７６８５/ｊｎａｕ.２０２００６０１６收稿日期:２０２０－０６－１４
基金项目：江苏省苏北科技专项(ＬＹＧ－ＳＺ２０１９２８)
作者简介：刘丹ꎬ硕士研究生ꎮ∗通信作者：胡春梅ꎬ副教授ꎬ硕导ꎬ研究方向为蔬菜分子生物学与遗传育种ꎬＥ￣ｍａｉｌ:ｊｊｊｈｃｍ＠ｎｊａｕ.ｅｄｕ.ｃｎꎮ
刘丹ꎬ周倩ꎬ孔祥雨ꎬ等.不结球白菜花青苷合成转录因子基因ＢｃＥＧＬ３的克隆及沉默分析[Ｊ].南京农业大学学报ꎬ２０２１ꎬ４４(２):２４９－２５８.ＬＩＵＤａｎꎬＺＨＯＵＱｉａｎꎬＫＯＮＧＸｉａｎｇｙｕꎬｅｔａｌ.ＣｌｏｎｉｎｇａｎｄｇｅｎｅｓｉｌｅｎｃｉｎｇｏｆａｎａｎｔｈｏｃｙａｎｉｎｓｙｎｔｈｅｓｉｓｒｅｇｕｌａｔｏｒｙｇｅｎｅＢｃＥＧＬ３ｉｎｎｏｎ￣ｈｅａｄｉｎｇＣｈ
ｉｎｅｓｅｃａｂｂａｇｅ[Ｊ].ＪｏｕｒｎａｌｏｆＮａｎｊｉｎｇＡｇｒｉｃｕｌｔｕｒａｌＵｎｉｖｅｒｓｉｔｙꎬ２０２１ꎬ４４(２):２４９－２５８.
不结球白菜花青苷合成转录因子基因ＢｃＥＧＬ３的克隆及沉默分析
刘丹１ꎬ周倩１ꎬ孔祥雨１ꎬ胡春梅１∗ꎬ侯喜林１ꎬ王建军１ꎬ２(１.南京农业大学作物遗传与种质创新国家重点实验室/农业农村部华东地区园艺作物生物学与种质创制重点实验室/园艺作物种质创新与利用教育部工程研究中心ꎬ江苏南京２１００９５ꎻ２.南京农业大学
连云港新农村发展研究院ꎬ江苏连云港２２２００２)
摘要:[目的]本文旨在探究ＢｃＥＧＬ３基因在不结球白菜紫色材料和其绿色突变体中的特性及其调控功能ꎮ[方法]以不结球白菜紫色自交系ＮＪＺＸ１￣３和其绿色突变体ＮＪＺＸ１￣０为材料ꎬ克隆ＢｃＥＧＬ３基因ꎻ构建表达载体ｐＲＩ１０１￣ＢｃＥＧＬ３ꎬ进行亚细胞定位ꎻ构建沉默载体ｐＴＹ￣ＢｃＥＧＬ３ꎬ分析材料中花青苷含量变化ꎬ以及ＢｃＥＧＬ３㊁ＢｃＤＦＲ基因在ＮＪＺＸ１￣３㊁ＮＪＺＸ１￣０㊁ｐＴＹ￣Ｓ和
ｐＴＹ￣ＢｃＥＧＬ３植株的基因表达量ꎻ对ＮＪＺＸ１￣３进行遮光处理ꎬ分析遮光后花青苷的积累以及ＢｃＥＧＬ３基因的转录水平变化ꎮ[结果]从ＮＪＺＸ１￣３和ＮＪＺＸ１￣０中克隆所得ＥＧＬ
３基因序列完全相同ꎬ序列长１８２１ｂｐꎬ含１个１８１８ｂｐ的开放阅读框(ＯＲＦ)ꎬ编码６０６个氨基酸ꎬ将其命名为ＢｃＥＧＬ３ꎮ蛋白结构分析表明ꎬＥＧＬ３蛋白属于ｂＨＬＨ￣ＭＹＣ￣Ｎ超家族ꎬ其蛋白结构较为简单ꎮ进化树结果表明ꎬＢｃＥＧＬ３蛋白与大白菜ＢｒａＥＧＬ３关系最近ꎬ同源性高达９９.９％ꎮ亚细胞定位结果显示ꎬＢｃＥＧＬ３
蛋白定位于细胞核中ꎮ基因沉默结果表明ꎬ与ＮＪＺＸ１￣３相比ꎬ转ｐＴＹ￣ＢｃＥＧＬ３或ｐＴＹ￣Ｓ植株叶片紫色变浅ꎬ且对应花青苷含量降低ꎮＲＴ￣ｑＰＣＲ结果表明ꎬＢｃＥＧＬ３和ＢｃＤＦＲ基因在转ｐＴＹ￣ＢｃＥＧＬ３植株中的相对表达量低于转ｐＴＹ￣Ｓ植株和ＮＪＺＸ１￣３植株ꎬ同时植株叶片颜色由紫色转为绿色ꎬ花青苷含量明显降低ꎬ但总叶绿素含量及类胡萝卜素含量无明显变化ꎮ遮光处理５ｄ后不结球白菜叶片中花青苷的含量比对照下降６８％ꎬ且１１ｄ时叶片中花青苷含量降幅最大ꎮ另外ꎬ遮光后ＢｃＥＧＬ３基因相对表达量呈下降趋势ꎬ与对照相比１４ｄ时下降幅度最大ꎮ[结论]ＢｃＥＧＬ３蛋白定位于细胞核ꎬＢｃＥＧＬ３基因沉默可以抑制叶片中花青苷的合成ꎬ且与ＢｃＤＦＲ基因的表达密切相关ꎬ因此在不结球白菜花青苷的合成过程中ＢｃＥＧＬ３基因起重要作用ꎮ
关键词：不结球白菜ꎻＢｃＥＧＬ３基因ꎻ亚细胞定位ꎻ花青苷ꎻ基因沉默
中图分类号:Ｓ６３４.３㊀㊀㊀㊀文献标志码:Ａ㊀㊀㊀㊀文章编号:１０００－２０３０(２０２１)０
２－０２４９－１０ＣｌｏｎｉｎｇａｎｄｇｅｎｅｓｉｌｅｎｃｉｎｇｏｆａｎａｎｔｈｏｃｙａｎｉｎｓｙｎｔｈｅｓｉｓｒｅｇｕｌａｔｏｒｙｇｅｎｅＢｃＥＧＬ３ｉｎｎｏｎ￣ｈｅａｄｉｎｇＣｈｉｎｅｓｅｃａｂｂａｇｅ
ＬＩＵＤａｎ１ꎬＺＨＯＵＱｉａｎ１ꎬＫＯＮＧＸｉａｎｇｙｕ１ꎬＨＵＣｈｕｎｍｅｉ１∗ꎬＨＯＵＸｉｌｉｎ１ꎬＷＡＮＧＪｉａｎｊｕｎ１ꎬ２(１.ＳｔａｔｅＫｅｙＬａｂｏｒａｔｏｒｙｏｆＣｒｏｐＧｅｎｅｔｉｃｓａｎｄＧｅｒｍｐｌａｓｍＥｎｈａｎｃｅｍｅｎｔ/ＫｅｙＬａｂｏｒａｔｏｒｙｏｆＢｉｏｌｏｇｙａｎｄＧｅｎｅｔｉｃＩｍｐｒｏｖｅｍｅｎｔｏｆＨｏｒｔｉｃｕｌｔｕｒａｌＣｒｏｐｓ(ＥａｓｔＣｈｉｎａ)ꎬＭｉｎｉｓｔｒｙｏｆＡｇｒｉｃｕｌｔｕｒｅａｎｄＲｕｒａｌＡｆｆａｉｒ/ＥｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇＲｅｓｅａｒｃｈＣｅｎｔｅｒｏｆＧｅｒｍｐｌａｓｍＥｎｈａｎｃｅｍｅｎｔａｎｄＵｔｉｌｉｚａｔｉｏｎｏｆＨｏｒｔｉｃｕｌｔｕｒａｌＣｒｏｐｓꎬＭｉｎｉｓｔｒｙｏｆＥｄｕｃａｔｉｏｎꎬＮａｎｊｉｎｇＡｇｒｉｃｕｌｔｕｒａｌＵｎｉｖｅｒｓｉｔｙꎬＮａｎｊｉｎｇ２１００９５ꎬＣｈｉｎａꎻ２.ＬｉａｎｙｕｎｇａｎｇＮｅｗＲｕｒａｌＤｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔＩｎｓｔｉｔｕｔｅꎬＮａｎｊｉｎｇＡｇｒｉｃｕｌｔｕｒａｌＵｎｉｖｅｒｓｉｔｙꎬＬｉａｎｙｕｎｇａｎｇ２２２００２ꎬＣｈｉｎａ)
Ａｂｓｔｒａｃｔ:[Ｏｂｊｅｃｔｉｖｅｓ]ＴｈｉｓａｒｔｉｃｌｅａｉｍｅｄｔｏｅｘｐｌｏｒｅｔｈｅｃｈａｒａｃｔｅｒｉｓｔｉｃｓａｎｄｒｅｇｕｌａｔｏｒｙｆｕｎｃｔｉｏｎｓｏｆＢｃ
ＥＧＬ３ｇｅｎｅｉｎｎｏｎ￣ｈｅａｄｉｎｇＣｈｉｎｅｓｅｃａｂｂａｇｅｐｕｒｐｌｅｍａｔｅｒｉａｌａｎｄｉｔｓｇｒｅｅｎｍｕｔａｎｔ.[Ｍｅｔｈｏｄｓ]Ｉｎｔｈｉｓｅｘｐｅｒｉｍｅｎｔꎬｔｈｅｎｏｎ￣ｈｅａｄｉｎｇＣｈｉｎｅｓｅｃａｂｂａｇｅｐｕｒｐｌｅｉｎｂｒｅｄｌｉｎｅＮＪＺＸ１￣３ａｎｄｉｔｓｇｒｅｅｎｍｕｔａｎｔＮＪＺＸ１￣０ｗｅｒｅｕｓｅｄａｓｍａｔｅｒｉａｌｓｔｏｃｌｏｎｅｔｈｅＢｃＥＧＬ３ｇｅｎｅ.ＴｈｅｎＢｃＥＧＬ３ｐｒｏｔｅｉｎｗａｓａｎａｌｙｚｅｄｆｏｒｓｕｂｃｅｌｌｕｌａｒｌｏｃａｔｉｏｎｂｙｃｏｎｓｔｒｕｃｔｉｎｇｔｈｅｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎｖｅｃｔｏｒｐＲＩ１０１￣ＢｃＥＧＬ３ꎬａｎｄｂｙｃｏｎｓｔｒｕｃｔｉｎｇｔｈｅｓｉｌｅｎｃｉｎｇｖｅｃｔｏｒｐＴＹ￣ＢｃＥＧＬ３ꎬｔｈｅｃｈａｎｇｅｓｏｆｔｈｅａｎｔｈｏｃｙａｎｉｎｃｏｎｔｅｎｔｉｎｔｈｅｍａｔｅｒｉａｌｓａｎｄｔｈｅｇｅｎｅｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎｌｅｖｅｌｓｏｆＢｃＥＧＬ３ａｎｄＢｃＤＦＲｇｅｎｅｓｉｎＮＪＺＸ１￣３ꎬＮＪＺＸ１￣０ꎬｐＴＹ￣ＳａｎｄｐＴＹ￣ＢｃＥＧＬ３ｐｌａｎｔｓｗｅｒｅａｎａｌｙｚｅｄ.ＩｎｔｈｅｅｎｄꎬｂｙｓｈａｄｉｎｇＮＪＺＸ１￣３ｍａｔｅｒｉａｌｓꎬｔｈｅａｃｃｕｍｕｌａｔｉｏｎｏｆａｎｔｈｏｃｙａｎｉｎｓａｎｄｔｈｅｃｈａｎｇｅｓｉｎｔｈｅｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎｌｅｖｅｌｏｆＢｃＥＧＬ３ｇｅｎｅｗｅｒｅａｎａｌｙｚｅｄ.[Ｒｅｓｕｌｔｓ]ＴｈｅＥＧＬ３ｇｅｎｅｓｅｑｕｅｎｃｅｃｌｏｎｅｄｆｒｏｍＮＪＺＸ１￣３ａｎｄＮＪＺＸ１￣０ｗａｓｃｏｍｐｌｅｔｅｌｙｉｄｅｎｔｉｃａｌ.Ｔｈｅｓｅｑｕｅｎｃｅｗａｓ１８２１ｂｐｉｎｌｅｎｇｔｈꎬｃｏｎｔａｉｎｉｎｇａｎｏｐｅｎｒｅａｄｉｎｇｆ
ｒａｍｅ(ＯＲＦ)ｏｆ１８１８ｂｐꎬｅｎｃｏｄｉｎｇ６０６ａｍｉｎｏａｃｉｄｓꎬａｎｄｎａｍｅｄＢｃＥＧＬ３.ＴｈｅａｎａｌｙｓｉｓｏｆｐｒｏｔｅｉｎｓｔｒｕｃｔｕｒｅｓｈｏｗｅｄｔｈａｔＥＧＬ３ｐｒｏｔｅｉｎ
０５２
南㊀京㊀农㊀业㊀大㊀学㊀学㊀报第４４卷ｂｅｌｏｎｇｅｄｔｏｔｈｅｂＨＬＨ￣ＭＹＣ￣Ｎｓｕｐｅｒｆａｍｉｌｙꎬａｎｄｉｔｓｐｒｏｔｅｉｎｓｔｒｕｃｔｕｒｅｗａｓｒｅｌａｔｉｖｅｌｙｓｉｍｐｌｅ.ＴｈｅｐｈｙｌｏｇｅｎｅｔｉｃｔｒｅｅｒｅｓｕｌｔｓｓｈｏｗｅｄｔｈａｔＢｃＥＧＬ３ｐｒｏｔｅｉｎｈａｄｔｈｅｃｌｏｓｅｓｔｒｅｌａｔｉｏｎｓｈｉｐｗｉｔｈＢｒａＥＧＬ３ｉｎＣｈｉｎｅｓｅｃａｂｂａｇｅꎬａｎｄｔｈｅｈｏｍｏｌｏｇｙｗａｓａｓｈｉｇｈａｓ９９.９％.ＴｈｅｒｅｓｕｌｔｓｏｆｓｕｂｃｅｌｌｕｌａｒｌｏｃａｌｉｚａｔｉｏｎｓｈｏｗｅｄｔｈａｔＢｃＥＧＬ３ｐｒｏｔｅｉｎｗａｓｌｏｃａｌｉｚｅｄｉｎｔｈｅｎｕｃｌｅｕｓ.ＴｈｅｇｅｎｅｓｉｌｅｎｃｉｎｇｒｅｓｕｌｔｓｓｈｏｗｅｄｔｈａｔꎬｃｏｍｐａｒｅｄｗｉｔｈＮＪＺＸ１￣３ｐｌａｎｔꎬｔｈｅｌｅａｖｅｓｏｆｔｒａｎｓｇｅｎｉｃｐＴＹ￣ＢｃＥＧＬ３ｏｒｐＴＹ￣Ｓｐｌａｎｔｓｂｅｃａｍｅｌｉｇｈｔｅｒｉｎｐｕｒｐｌｅａｎｄｔｈｅｃｏｒｒｅｓｐｏｎｄｉｎｇａｎｔｈｏｃｙａｎｉｎｃｏｎｔｅｎｔｄｅｃｒｅａｓｅｄ.ＲＴ￣ｑＰＣＲｒｅｓｕｌｔｓｓｈｏｗｅｄｔｈａｔｔｈｅｒｅｌａｔｉｖｅｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎｌｅｖｅ
ｌｓｏｆＢｃＥＧＬ３ａｎｄＢｃＤＦＲｇｅｎｅｓｉｎｐＴＹ￣ＢｃＥＧＬ３ｐｌａｎｔｓｗｅｒｅｌｏｗｅｒｔｈａｎｔｈｏｓｅｉｎｔｒａｎｓｇｅｎｉｃｐＴＹ￣ＳａｎｄＮＪＺＸ１￣３ｐｌａｎｔｓꎬａｎｄｔｈｅｃｏｌｏｒｏｆｐｌａｎｔｌｅａｖｅｓｃｈａｎｇｅｄｆｒｏｍｐｕｒｐｌｅｔｏｇｒｅｅｎꎬａｎｄｔｈｅａｎｔｈｏｃｙａｎｉｎｃｏｎｔｅｎｔｓｉｇｎｉｆｉｃａｎｔｌｙｄｅｃｒｅａｓｅｄ.Ｂｕｔｔｈｅｔｏｔａｌｃｈｌｏｒｏｐｈｙｌｌｃｏｎｔｅｎｔａｎｄｃａｒｏｔｅｎｏｉｄｃｏｎｔｅｎｔｄｉｄｎｏｔｃｈａｎｇｅｓｉｇｎｉｆｉｃａｎｔｌｙ.Ｔｈｅａｎｔｈｏｃｙａｎｉｎｃｏｎｔｅｎｔｉｎｎｏｎ￣ｈｅａｄｉｎｇＣｈｉｎｅｓｅｃａｂｂａｇｅｌｅａｖｅｓｄｅｃｒｅａｓｅｄｂｙ６８％ｃｏｍｐａｒｅｄｗｉｔｈｔｈｅｃｏｎｔｒｏｌａｆｔｅｒｓｈａｄｉｎｇｔｒｅａｔｍｅｎｔｆｏｒ５ｄａｙｓꎬａｎｄｔｈｅａｎｔｈｏｃｙａｎｉｎｃｏｎｔｅｎｔｉｎｌｅａｖｅｓｄｅｃｒｅａｓｅｄｔｈｅｍｏｓｔｏｎ１１ｄａｙｓ.ＩｎａｄｄｉｔｉｏｎꎬｔｈｅＢｃＥＧＬ３ｇｅｎｅｓｈｏｗｅｄａｄｏｗｎｗａｒｄｔｒｅｎｄａｆｔｅｒｓｈａｄｉｎｇꎬｗｉｔｈｔｈｅｌａｒｇｅｓｔｄｅｃｌｉｎｅａｔ１４ｄｃｏｍｐａｒｅｄｗｉｔｈｔｈｅｃｏｎｔｒｏｌ.[Ｃｏｎｃｌｕｓｉｏｎｓ]ＢｃＥＧＬ３ｗａｓｌｏｃａｔｅｄｉｎｔｈｅｎｕｃｌｅｕｓ.ＢｃＥＧＬ３ｇｅｎｅｓｉｌｅｎｃｉｎｇｃｏｕｌｄｉｎｈｉｂｉｔｔｈｅｓｙｎｔｈｅｓｉｓｏｆａｎｔｈｏｃｙａｎｉｎｓｉｎｌｅａｖｅｓꎬａｎｄｗａｓｃｌｏｓｅｌｙｒｅｌａｔｅｄｔｏｔｈｅｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎｏｆＢｃＤＦＲｇｅｎｅꎬａｎｄｐｌａｙｅｄａｎｉｍｐｏｒｔａｎｔｒｏｌｅｉｎｔｈｅｐｒｏｃｅｓｓｏｆｎｏｎ￣ｈｅａｄｉｎｇｃａｂｂａｇｅａｎｔｈｏｃｙａｎｉｎｓｙｎｔｈｅｓｉｓ.
呼叫失败
Ｋｅｙｗｏｒｄｓ:Ｂｒａｓｓｉｃａｃａｍｐｅｓｔｒｉｓｓｓｐ.ｃｈｉｎｅｎｓｉｓꎻＢｃＥＧＬ３ｇｅｎｅꎻｓｕｂｃｅｌｌｕｌａｒｌｏｃａｌｉｚａｔｉｏｎꎻａｎｔｈｏｃｙａｎｉｎꎻｇｅｎｅｓｉｌｅｎｃｉｎｇ不结球白菜(Ｂｒａｓｓｉｃａｃａｍｐｅｓｔｒｉｓｓｓｐ.ｃｈｉｎｅｎｓｉｓ)富含对人体有利的维生素Ｃ㊁粗纤维和花青苷ꎬ紫色不结球白菜中的花青苷含量尤为丰富ꎮ花青苷是糖基化的多酚类化合物ꎬ易溶于水ꎬ是蔬菜和水果重要的呈色物质ꎮ花青苷能够保护植物抵抗各种生物和非生物胁迫[１]ꎬ花青苷在人体中还具有抗氧化[２]㊁抗癌[３]ꎬ降低血压[４]和血脂[５]ꎬ减缓阿尔兹海默症[６]等功效ꎮ
ＥＧＬ３(ＥｎｈａｎｃｅｒｏｆＧｌａｂｒａ３)基因属于Ⅲｆ亚类ｂＨＬＨ转录因子ꎬ可以通过调控花青苷合成途径中某个结构基因ꎬ实现对植物体内花青苷含量的调控作用ꎮＥＧＬ３蛋白具有典型碱性螺旋环螺旋结构域ꎬｂＨＬＨ结构域具有２个不同的功能区域:ＨＬＨ和ＢＡＳＩＣ[７]ꎬ其中ＨＬＨ可以促进蛋白互作ꎬ形成同源二聚体或异源二聚体[８]ꎻＢＡＳＩＣ位于ｂＨＬＨ结构域的Ｎ末端ꎬ与ＤＮＡ顺式元件Ｅ￣ｂｏｘ(５ᶄ￣ＣＡＮＮＴＧ￣３ᶄ)和Ｇ￣ｂｏｘ(５ᶄ￣ＣＡＣＧＴＧ￣３ᶄ)结合调控基因的表达[９]ꎮＤＦＲ基因是花青苷合成途径中结构基因ꎮ二氢黄酮醇－４－还原酶(ｄｉｈｙｄｒｏｆａｖｏｎｏｌ４￣ｒｅｄｕｃｔａｓｅꎬＤＦＲ)是花青苷生物合成代谢中的关键酶ꎬ影响花青苷的组成和色素沉着ꎬ是植物呈色的关键酶ꎬ也是花色形成的重要调控点ꎮＤａｎｉｌｏ等[１０]对缺失ＤＦＲ基因的番茄纯合子的胚轴和愈伤组织进行体外培养ꎬ之后对再生绿色小植株的胚轴和愈伤组织靶
向插入ＤＦＲ基因ꎬ结果再生小植株由绿色转为紫色ꎮ于婷婷[１１]在龙胆试验中检测发现ꎬＤＦＲ基因过表达的转基因橙花龙胆与野生型相比红色更深ꎬ花青苷含量更高ꎮＮｅｓｉ等[１２]发现在过表达ＥＧＬ３的转基因拟南芥植株中ꎬＤＦＲ的表达量增加ꎬ叶片由绿色转为紫色ꎬ证明ＥＧＬ３通过调控花青苷合成途径中ＤＦＲ基因实现对花青苷的调控ꎮＥＧＬ３基因还可与其他调控因子ＰＡＰ１/２㊁ＴＴＧ１一起形成复合体ꎬ共同调控ＤＦＲ基因的表达调控[１３]ꎮ本研究采用同源克隆方式以不结球白菜紫色自交系ＮＪＺＸ１￣３及其绿色突变体ＮＪＺＸ１￣０为材料克隆获得ＢｃＥＧＬ３基因ꎬ利用生物信息学方法分析其结构及保守域ꎬ并预测其蛋白结构ꎻ构建ｐＲＩ１０１￣ＢｃＥＧＬ３载体ꎬ对ＢｃＥＧＬ３进行亚细胞定位分析ꎻ构建ｐＴＹ￣ＢｃＥＧＬ３沉默载体ꎬ对ＢｃＥＧＬ３基因进行功能验证ꎻ对ＮＪＺＸ１￣３进行遮光处理ꎬ检测叶片花青苷含量以及ＢｃＥＧＬ３基因的转录水平ꎬ旨在为紫色不结球白菜中花青苷合成的分子调控机制奠定生物学基础ꎮ
１㊀材料与方法
１.１㊀试验材料
供试材料为不结球白菜紫色材料ＮＪＺＸ１￣３及其经过秋水仙素诱导所产生的非加倍绿色突变体ＮＪＺＸ１￣０(图１)ꎬ由南京农业大学白菜系统生物学实验室提供ꎮ将不结球白菜种子先用体积分数为７０％的乙醇杀菌消毒后ꎬ再用超净水冲洗ꎬ室温催芽２ｄ左右ꎬ移至穴盘ꎬ放置在气候室(光/暗时间为与虎谋皮的意思
１６ｈ/８ｈꎬ光/暗温度为２２ħ/１８ħ)ꎮ另外ꎬ取７叶期健壮ＮＪＺＸ１￣３材料用遮阳网进行遮光处理ꎬ分别在处理后０㊁３㊁７㊁１１和１４ｄ时取样ꎬ每个处理设３次重复ꎮ以同期自然条件下生长的健壮幼苗为对照组ꎮ１.２㊀ＲＮＡ的提取及ｃＤＮＡ的合成
取０.１ｇ试验材料７叶期的叶片ꎬ置于加入锆珠的２ｍＬ磨样管中ꎬ液氮速冻ꎮ用磨样机(程序为４５Ｈｚ９０ｓ)磨样完成后ꎬ用ＲＮＡ提取试剂盒(ＴａＫａＲａ)提取ＲＮＡꎮ使用ＰｒｉｍｅＳｃｒｉｐｔＲＴＲｅａｇｅｎｔＫｉｔ(ＴａＫａＲａ)合成ｃＤＮＡꎬ用于ＢｃＥＧＬ３基因的克隆ꎮ
㊀第２期刘丹ꎬ等：不结球白菜花青苷合成转录因子基因ＢｃＥＧＬ３
的克隆及沉默分析图１㊀不结球白菜的表型
Ｆｉｇ １㊀Ｔｈｅｐｈｅｎｏｔｙｐｅｏｆｎｏｎ￣ｈｅａｄｉｎｇＣｈｉｎｅｓｅｃａｂｂａｇｅ
１.３㊀ＢｃＥＧＬ３基因的克隆
在大白菜数据库(ＢＲＡＤꎬｈｔｔｐ://ｂｒａｓｓｉｃａｄｂ.ｏｒｇ/ｂｒａｄ/ｉｎｄｅｘ.ｐｈｐ)中ꎬ查询ＢｃＥＧＬ３同源基因ＢｒａＥＧＬ３(Ｂｒａ０２７７９６)设计特异引物(表１)ꎬ并以反转录得到的第１链ｃＤＮＡ为模板ꎬ进行ｃＤＮＡ克隆ꎮＰＣＲ总体系为２０μＬ：模板１μＬꎬ正㊁反引物各１μＬꎬＩ￣５ＴｔＭｎ２ˑＨｉｇｈ￣ＦｉｄｅｌｉｔｙＭａｓｔｅｒＭｉｘ酶(南京擎科生物科技有限公司)１０μＬꎬｄｄＨ２Ｏ７μＬꎮ设３个重复ꎮ反应程序:９５ħ５ｍｉｎꎻ９５ħ３０ｓꎬ５９.６ħ３０ｓꎬ７２ħ２ｍｉｎꎬ３５个循环ꎻ７２ħ１０ｍｉｎꎮＰＣＲ产物经１５ｇ Ｌ－１凝胶电泳检测后ꎬ回收目的片段ꎬ经大肠杆菌转化后ꎬ挑取单菌落送南京擎科生物科技有限公司进行测序ꎮ
表１㊀本文所用引物序列
Ｔａｂｌｅ１㊀Ｐｒｉｍｅｒｓｅｑｕｅｎｃｅｓｉｎｔｈｉｓｓｔｕｄｙ邓稼先传
引物对名称Ｐｒｉｍｅｒｐａｉｒｓｎａｍｅ
引物对序列Ｐｒｉｍｅｒｐａｉｒｓｓｅｑｕｅｎｃｅ(５ᶄң３ᶄ)用途ＵｓａｇｅＢｃＥＧＬ３￣Ｆ/Ｒ
ＣＡＴＡＴＧＡＴＧＧＣＴＡＣＴＧＧＡＧＡＡＡＡＣＡ/ＧＧＡＴＣＣＡＣＡＴＡＴＣＣＡＴＧＣＡＡＣＴＣＴＴＴＧ扩增保守片段ＴｈｅｃｏｎｓｅｒｖｅｄｆｒａｇｍｅｎｔＢｃＥＧＬ３.１￣Ｆ/Ｒ
ＴＴＣＴＴＣＡＣＴＧＴＴＧＡＴＡＣＡＴＡＴＧＡＴＧＧＣＴＡＣＴＧＧＡＧＡＡＡＡＣＡＧＡＡＣＣＧＴＧ/ＴＣＧＣＣＣＴＴＧＣＴＣＡＣＣＡＴＧＧＡＴＣＣＡＣＡＴＡＴＣＣＡＴＧＣＡＡＣＴＣＴＴＴＧＡＡＧ荧光载体的构建ＣｏｎｓｔｒｕｃｔｉｏｎｏｆｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｔｖｅｃｔｏｒＢｃＥＧＬ３￣Ａ/Ｓ
ＣＡＧＡＡＣＣＧＴＧＣＡＧＧＡＡＡＡＴＣＴ/ＴＣＣＡＴＣＴＣＣＣＣＡＴＴＣＣＡＧＣＡ检测ＢｃＥＧＬ３的表达ＴｈｅｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎｏｆＢｃＥＧＬ３ＢｃＤＦＲ￣Ａ/Ｓ
ＣＣＡＡＧＡＡＧＡＴＧＡＣＡＧＧＡＴ/ＧＴＴＡＣＧＡＧＴＧＡＴＡＧＧＡＧＡＧ检测ＢｃＤＦＲ的表达ＴｈｅｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎｏｆＢｃＤＦＲＡｃｔｉｎ￣Ａ/ＳＧＴＴＧＣＴＡＴＣＣＡＧＧＣＴＧＴＴＣＴ/ＡＧＣＧＴＧＡＧＧＡＡＧＡＧＣＡＴＡＡＣ内参基因Ｔｈｅｉｎｔｅｒｎａｌｇｅｎｅ１.４㊀ＥＧＬ３基因序列及其蛋白的生物信息学分析
利用ＢｉｏＸＭ２.６对ＥＧＬ３进行ＯＲＦ查找㊁翻译ꎻ利用ＮＣＢＩ(ｈｔｔｐｓ://ｗｗｗ.ｎｃｂｉ.ｎｌｍ.ｎｉｈ.ｇｏｖ/)中的分析工具对ＥＧＬ３蛋白质理化性质进行分析ꎻ利用ＤＮＡＭＡＮ７程
冬天有什么花开放序进行多重序列比对ꎻ利用ＴＭｐｒｅｄ在线软件(ｈｔｔｐｓ://ｗｗｗ.ｃｈ.ｅｍｂｎｅｔ.ｏｒｇ/ｓｏｆｔｗａｒｅ/ＴＭＰＲＥＤ＿ｆｏｒｍ.ｈｔｍｌ)预测ＥＧＬ３的跨膜结构ꎻ利用ＭＥＧＡ５程序构建系统进化树ꎻ利用在线的ＳＭＡＲＴ(ｈｔｔｐ://ｓｍａｒｔ.ｅｍｂｌ￣ｈｅｉｄｅｌｂｅｒｇ.ｄｅ)进行结构域分析ꎻ利用ＷｅｂＬｏｇｏ(ｈｔｔｐ://ｗｅｂｌｏｇｏ.ｂｅｒｋｅｌｅｙ.ｅｄｕ/ｌｏｇｏ.ｃｇｉ)在线程序分析ＥＧＬ３转录因子蛋白结构域的保守位点ꎮ
１.５㊀ＢｃＥＧＬ３的亚细胞定位检测设计２条特异性引物ＢｃＥＧＬ３.１￣Ｒ和ＢｃＥＧＬ３.１￣Ｆꎬ以ｐＥＡＳＹ￣ＢｃＥＧＬ３.１载体质粒为模板ꎬ采用高保真酶扩增目标片段ꎬ电泳检测后切胶回收ꎮ用限制性内切酶对表达载体ｐＲＩ１０１进行双酶切ꎮ反应产物经凝胶(１５ｇ Ｌ－１)电泳检测后ꎬ胶回收酶切目的片段ꎮ用ＣｌｏｎＥｘｐｒｅｓｓⅡＯｎｅＳｔｅｐＣｌｏｎｉｎｇＫｉｔ(南京诺唯赞生物科技有限公司)同源重组上述胶回收片段ꎬ经大肠杆菌转化后ꎬ挑取单菌落送南京擎科生物科技有限公司进行测序ꎬ返样后提取质粒ꎬ于－７０ħ冰箱中保存备用ꎮ
将上述提取的质粒采用冻融法转化到农杆菌ＧＶ３１０１中ꎬ均匀涂在含有卡那霉素(５０ｍｇ Ｌ－１)和利福平(５０ｍｇ Ｌ－１)的ＬＢ固体培养基上ꎬ在２８ħ恒温培养箱中倒置培养ꎮ２ｄ后挑取单菌落于４００μＬ含卡那霉素和利福平的ＬＢ液体培养基的灭菌管中ꎻ在２８ħ过夜摇菌ꎬ将摇好的菌液转移到５０ｍＬ管中摇至菌１
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南㊀京㊀农㊀业㊀大㊀学㊀学㊀报第４４卷液Ｄ６００＝１.０ꎻ６０００ｒ ｍｉｎ－１离心５ｍｉｎꎬ弃上清液ꎬ用含１０ｍｍｏｌ Ｌ－１ＭＥＳ㊁１０ｍｍｏｌ Ｌ－１ＭｇＣｌ２和１５０ｍｏｌ Ｌ－１的乙酰丁香酮注射缓冲液重悬菌液ꎻ将菌液调至Ｄ６００＝０.８ꎬ室温静置４ｈꎻ将Ｐ１９㊁ＲＦＰ㊁ＥＧＬ３基因按０.５ʒ１ʒ１的体积比混匀ꎬ用１ｍＬ灭菌的去掉针头的注射器ꎬ注射种植时间为１个月的烟草叶片背面ꎮ将注射后的烟草置于气候室ꎬ气候室条件为：光/暗时间为１６ｈ/８ｈꎬ光/暗温度为２２ħ/１８ħꎮ３ｄ后利用激光共聚焦显微镜观察并拍照ꎮ国考什么时候出成绩
１.６㊀病毒诱导的基因沉默表达载体的构建ｐＴＹ￣ＢｃＥＧＬ３的载体构建主要采用杨学东等[１４]的方法ꎮＢｃＥＧＬ３选取的４０ｂｐ序列为:５ᶄ￣ＴＡＡＡ￣
ＧＡＡＡＣＡＣＣＴＣＧＣＡＧＴＴＴＣＡＧＴＴＣＧＡＡＡＣＡＴＴＣＡＡＴＧ￣３ᶄꎬ在南京金斯瑞生物科技有限公司分别合成反向互补序列８０ｂｐꎮｐＴＹ载体用ＮｄｅⅠ酶切后ꎬ用Ｔ４连接酶与合成好的ＤＮＡ片段过夜连接ꎬ转化大肠杆菌ꎬ挑取阳性单克隆ꎬ测序验证ꎮ提取ｐＴＹ￣ＢｃＥＧＬ３质粒ꎬ用金粉包埋后ꎬ用基因枪(１０００ｐｓｉ)导入到７叶期的ＮＪＺＸ１￣３中ꎬ以ｐＴＹ空载质粒的ＮＪＺＸ１￣３(ｐＴＹ￣Ｓ)作为对照ꎬ２０ｄ后ꎬ观察植株表型变化ꎮ选取ｐＴＹ载体中的ＣＰ(ｃｏａｔｐｒｏｔｅｉｎ)基因片段设计特异引物(ＣＰ￣Ｆ:５ᶄ￣ＴＣＣＡＣＣＣＴＣＡＣＣＡＣＣＴＴＣ￣３ᶄ和ＣＰ￣Ｒ:５ᶄ￣ＧＧＧＡ￣ＣＡＧＡＣＣＴＣＧＣＴＡＡＣＴ￣３ᶄ)ꎬＰＣＲ检测转基因植株[１５]ꎮ１.７㊀不结球白菜总花青苷含量的测定采用董慧杰[２]的方法并稍加改动ꎮ取冷冻干
燥叶片０.１ｇꎬ用液氮研磨后ꎬ加入１.５ｍＬ酸化乙醇(用体积分数为５％的ＨＣｌ进行酸化)ꎬ在适当摇晃㊁避光条件下浸提２４ｈꎮ
１.８㊀实时荧光定量ＰＣＲ表达分析根据克隆所得ＥＧＬ３基因的ｃＤＮＡ全长序列ꎬ采用在线软件Ｐｒｉｍｅｒ￣ＢＬＡＳＴ设计正㊁反引物(表１)ꎬＡｃｔｉｎ基因作为内参ꎮ试验步骤及用量参考ＳＹＢＲＰｒｅｍｉｘＥｘＴａｑＴＭＮＪＺＸ１￣０Ⅱ(ＴａＫａＲａ)试剂盒说明书ꎮ反应总体系２０μＬ：模板１μＬꎬ正㊁反引物各０.５μＬꎬＳＹＢＲＰｒｅｍｉｘＥｘＴａｑ１０μＬꎬｄｄＨ２Ｏ８μＬꎮ采用２－ΔΔＣＴ法[１６]计算基因的相对表达量ꎮ每个反应设３次生物学重复ꎮ程序为标准的两步法ꎬ在７５００实时荧光定
量ＰＣＲ仪(美国ＡｐｐｌｉｅｄＢｉｏｓｙｓｔｅｍｓ)上进行定量分析ꎮ２㊀结果与分析
２.１㊀不结球白菜ＥＧＬ３基因的克隆及序列分析
香石竹分别从ＮＪＺＸ１￣３和ＮＪＺＸ１￣０中分离出２个ｃＤＮＡ克隆片段ꎬ测序结果(图２)显示ꎬ这２个片段的基因序列完全一致ꎬ长１８２１ｂｐꎬ将其命名为ＢｃＥＧＬ３ꎮ核苷酸序列比对结果显示ꎬＢｃＥＧＬ３含有１个长为１８１８ｂｐ的开放阅读框(ＯＲＦ)ꎬ编码６０６个氨基酸ꎬ其中含酸性氨基酸６３个ꎬ碱性氨基酸８４个
ꎮ
图２㊀不结球白菜ＥＧＬ３基因的核苷酸序列及其对应的氨基酸序列
Ｆｉｇ ２㊀ＴｈｅｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅａｎｄｄｅｄｕｃｅｄａｍｉｎｏａｃｉｄｓｓｅｑｕｅｎｃｅｏｆＥＧＬ３ｇｅｎｅ
ｉｎＢｒａｓｓｉｃａｃａｍｐｅｓｔｒｉｓｓｓｐ.ｃｈｉｎｅｎｓｉｓ
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㊀第２期刘丹ꎬ等：不结球白菜花青苷合成转录因子基因ＢｃＥＧＬ３的克隆及沉默分析２.２㊀ＢｃＥＧＬ３蛋白的特征分析
对ＢｃＥＧＬ３蛋白结构分析显示ꎬ该蛋白的等电点为４.９８ꎬ分子结构式为Ｃ５４６９Ｈ９１１９Ｎ１８２１Ｏ２２８９Ｓ３５４ꎬ相对分子
质量为６.７９５ˑ１０４ꎬ为亲水性蛋白ꎮ氨基酸组成中Ａｌａ(ａ)丙氨酸所占比例最大ꎮ保守域分析结果表明ꎬＥＧＬ３蛋白属于ｂＨＬＨ￣ＭＹＣ￣Ｎ超家族ꎮ利用在线软件ＳＯＰＭＡ预测ＥＧＬ３编码蛋白二级结构ꎬ结果表明(图３)ꎬＥＧＬ３含有α－螺旋２３６个(３８.９４％)ꎬ无规则卷曲２８１个(
４６.３７％)ꎬ含有β－转角２３个(３.８０％)和延伸链６６个(１０.８９％)ꎮＥＧＬ３蛋白的三级结构(图４)的预测结果与二级结构的基本相符手指简笔画
塞特神
ꎮ图３㊀ＢｃＥＧＬ３蛋白的二级结构
Ｆｉｇ ３㊀ＴｈｅｐｒｅｄｉｃｔｅｄｓｅｃｏｎｄａｒｙｓｔｒｕｃｔｕｒｅｏｆＢｃＥＧＬ３ｐｒｏｔｅｉｎ
图中蓝色为α－螺旋ꎬ红色为β－折叠ꎬ绿色为β－转角ꎬ紫色为无规则卷曲ꎮ
Ｉｎｆｉｇｕｒｅꎬｂｌｕｅｒｅｐｒｅｓｅｎｔｓａｌｐｈａｈｅｌｉｘꎬｒｅｄｒｅｐｒｅｓｅｎｔｓｂｅｔａｆｏｌｄｉｎｇꎬｇｒｅｅｎｒｅｐｒｅｓｅｎｔｓｂｅｔａｃｏｒｎｅｒａｎｄｐｕｒｐｌｅｒｅｐｒｅｓｅｎｔｓｉｒｒｅｇｕｌａｒ
ｃｕｒｌｉｎｇ.
图４㊀ＢｃＥＧＬ３蛋白质三级结构
Ｆｉｇ ４㊀ＴｈｅｐｒｅｄｉｃｔｅｄｔｅｒｔｉａｒｙｓｔｒｕｃｔｕｒｅｏｆＢｃＥＧＬ３ｐｒｏｔｅｉｎ
ａ.α－螺旋α￣ｈｅｌｉｘꎻｂ.延伸链Ｅｘｔｅｎｄｅｄｓｔｒａｎｄꎻｃ.随机卷曲Ｒａｎｄｏｍｃｏｉｌｓ.２.３㊀ＢｃＥＧＬ３蛋白的同源性比较及进化树分析
利用ＢＬＡＳＴｐ对ＢｃＥＧＬ３蛋白序列进行同源检索ꎬ并进行多重序列比对ꎮ结果(图５)显示：在７个物种的ＥＧＬ３蛋白序列中ꎬＢｃＥＧＬ３蛋白与大白菜中的ＥＧＬ３同源性高达９９.９０％ꎬ其次是油菜和甘蓝ꎬ同源性分别为９８.６８％和９８.４６％ꎮ
根据蛋白质的序列构建分子进化树ꎬ结果(图６)表明ꎬＥＧＬ３蛋白的进化关系与植物学分类一致ꎬ不同物种之间有明显的种属关系ꎮ十字花科植物归为一大类ꎬ包括芸薹属这一小支ꎬ属于其他科属的植物也各自分别归类ꎮＢｃＥＧＬ３蛋白与欧洲油菜㊁大白菜㊁甘蓝和萝卜中的ＥＧＬ３蛋白聚为同一组ꎬ彼此亲缘关系较近ꎬ表明ＢｃＥＧＬ３蛋白可能具有相似的编码和调控功能ꎮ２.４㊀ＢｃＥＧＬ３亚细胞定位分析
由图７可见:ｐＲＩ１０１￣ＢｃＥＧＬ３荧光表达载体在ＧＦＰ通道下可以被激发ꎬ发出明显的绿色
荧光信号ꎮ细胞核ｍａｒｋｅｒ用来标识细胞核的位置ꎬ在ＲＦＰ通道下发出明显的红色荧光信号ꎮ利用激光共聚焦显微镜观察注射３ｄ后的烟草叶片ꎬ发现绿色荧光信号和红色荧光信号在细胞核位置重叠ꎮ表明ＢｃＥＧＬ３蛋白定位于细胞核中ꎮ３５２
