·论著·
高雄激素对性成熟前小鼠颗粒细胞
增殖和凋亡的影响
江帆
李梅简单又漂亮的贺卡
赵考考
刁飞扬
马翔
崔毓桂
高速限速规定刘嘉茵
DOI ：10.3877/cma．j．issn．1674-0785．2012．05．023
基金项目：国家自然科学基金（81070465）；973项目（2012CB944902）作者单位：210029
南京医科大学第一附属医院生殖医学科
yin娃荡女
通讯作者：刘嘉茵，
Email ：jyliu_nj@126．com 【摘要】目的观察高浓度雄激素对性成熟前小鼠卵巢颗粒细胞增殖、凋亡的影响，初步探讨其机制，
为研究多囊卵巢综合征（PCOS ）病理生理机制积累更多的实验资料。方法体外培养21d 龄小鼠卵巢颗粒
细胞，用不同浓度的睾酮（10
－5
，10
－6
，10
－8
mol /L ）作用24、48、72h ，噻唑蓝（MTT ）比色法检测细胞活力，流式
细胞术检测细胞周期和细胞凋亡，
Realtime PCR 检测Caspa-3/9、Bcl-2、Bax 等凋亡因子的变化。结果10－5mol /L 睾酮显著增加颗粒细胞的细胞活力；10－5
mol /L 睾酮作用48h ，细胞周期由G1期进入S
期，细胞早期凋亡率减少1.36%，Caspa-3活性降低，Caspa-3/9、Bcl-2、Bax mRNA 水平表达均下降。结论
高浓度雄激素增加性成熟前的卵巢颗粒细胞的细胞活力，促进细胞增殖，抑制细胞凋亡，其作用可能
通过抑制线粒体通路相关的凋亡因子的表达。本研究提示，性成熟前的高雄激素作用，可能是导致青春期PCOS 发生的原因之一。
【关键词】多囊卵巢综合征；
粒层细胞；
细胞增殖；
细胞凋亡；
雄激素增多症
Effect of hyperandrogen on the proliferation and apoptosis of ovarian granulosa cells of pre-adolescent mou
JIANG Fan ，LI Mei ，ZHAO Kao-kao ，DIAO Fei-yang ，MA Xiang ，CUI Yu-gui ，LIU Jia-yin．State Key
Laboratory of Reproductive Medicine ，Clinical Center of Reproductive Medicine ，First Affiliated Hospital ，Nanjing Medical University ，Nanjing 210029，China
Corresponding author ：LIU Jia-yin ，Email ：jyliu_nj@126．com 【Abstract 】Objective
To obrve the effect of testosterone on the proliferation and apoptosis of ovarian
granulo cells （GCs ）of pre-adolescent mou ，so as to investigate the pathophysiological mechanism of adolescent polycystic ovary syndrome （PCOS ）．Methods
GCs from mou pre-adolescent ovary were differently treated with
testosterone at higher concentration of 10－5，10－6，10－8mol /L for 24，48，72h．Cell viability and growth rate of GCs were assayed by MTT methods．After exposure to testosterone （10－5mol /L ）for 48h ，cell cycle and apoptosis rate of GCs were detected by flow cytometry．Caspa-3activity was detected by absorption spectrometry．Expressions of Caspa-3/9，
Bcl-2and Bax mRNAs in the treated GCs were determined by real-time RT-RCR．Results Cell
viability of pre-adolescent mou GCs was significantly incread in the group treated with testosterone at 10－5mol /L （P ＜0.05）．When compared with the control group ，the cell cycle from G1pha into S pha in the testosterone exposure group significantly changed ，while the early apoptosis rate significantly decread by 1.36%（P ＜0.05）．Caspa-3activity significantly decread in the testosterone treated group ，and the expression levels of Caspa-3/9，Bcl-2and Bax mRNAs significantly decread （P ＜0.05）．Conclusions
Androgen at higher level can promote cell
viability and inhibit the early apoptosis of GCs by inhibiting the mitochondrial pathway of apoptosis-related factor expression．This study suggests that hyperandrogenism in pre-adolescent ovary may be part of pathophysiological mechanism of adolescent PCOS．
【Key words 】Polycystic ovary syndrome ；Granulosa cells ；
Cell proliferation ；
Apoptosis ；
Hyperandro-
genism
多囊卵巢综合征（polycystic ovary syndrome ，PCOS ）是青春期及育龄妇女常见的异质性内分泌疾病，以高
雄激素血症及慢性无排卵为临床特征。PCOS 卵巢所
含窦状卵泡是正常卵巢的2 3倍，卵泡发育到4 7mm 时便停止发育［1］。青春期PCOS 的发病，过多的雄激素是一个关键的因素，而高雄激素又是卵巢内小
卵泡过多的原因之一［2］
。雄激素受体在卵泡发育的早
期即有表达，
并在窦前卵泡和小窦状卵泡的颗粒细胞
上表达最为显著。研究证实［3-5］，高雄激素作用可以增加恒河猴和啮齿类动物卵巢窦前卵泡和小窦状卵泡的数量。在卵泡的生长发育过程中，作为卵泡体细胞的颗粒细胞，通过细胞间的相互作用，对卵泡膜细胞和卵母细胞的发育、成熟及其功能起重要的调控作用，进而影响卵泡的启动、发育、成熟及闭锁的全过程［6-7］。因此，颗粒细胞的分化、生长和凋亡在原始卵泡启动及之后的卵泡发育与闭锁中都起重要作用。本文旨在观察高雄激素调控性成熟前小鼠的卵巢颗粒细胞的增殖和凋亡，探讨其分子信号机制，进而讨论对卵泡发育与闭锁的影响，为进一步探索青春期PCOS的病理生理机制积累更多的资料。
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材料和方法
一、主要试剂与仪器
睾酮、二甲基亚砜（DMSO）、四甲基偶氮唑蓝（MTT）为美国Sigma公司产品，DMEM/F12培养液为Hyclone公司产品，胎牛血清（FBS）为杭州四季青生物公司产品，透明质酸酶为美国罗氏公司产品，胰酶细胞消化液为碧云天生物技术研究所产品，Caspa-3活化度由凯基公司用分光光度法检测试剂盒检测，Bcl-2、Bax、Caspa-3/9引物合成于上海英骏生物技术有限公司，RNA抽提试剂盒、cDNA合成试剂盒、PCR扩增试剂盒、DNA marker DL2000为日本TakaRa公司产品；酶标仪Model680为美国BIORAD公司产品，FACSCalibur 流式细胞仪为美国BD公司产品，Prism7300型荧光定量PCR仪为美国ABI公司产品。
心理开导二、细胞来源及培养
选择21d龄雌性ICR小鼠，购置于南京医科大学实验动物中心。脱颈椎法处死小鼠，无菌条件下取出卵巢置于PBS中，清洗三遍，加入含10%FBS的DMEM/F12培养液置于37ħ，5%CO
2
细胞培养箱中孵育15min，用细针反复刺破卵巢内卵泡，使颗粒细胞释放入DMEM培养液中，加入0.1%透明质酸酶消化分离细胞2min后，用200目筛网过滤培养液后离心收集细胞，用PBS洗涤1次后加入10%FBS的DMEM/ F12培养液（含100U/ml青霉素、链霉素）重悬细胞，将细胞均匀接种到60mm培养皿中，置入37ħ、5%
CO
2
培养箱中培养，24h后细胞可贴壁生长。
三、MTT检测不同浓度睾酮对青春期前小鼠卵巢颗粒细胞增殖的影响
取对数生长期的颗粒细胞，调整细胞浓度至1ˑ108cell/L接种于96孔板，每孔200μl，每组6个副孔，分别予不同浓度睾酮10－8、10－6、10－5mol/L处理24h，48h，72h。每孔加入5g/L MTT溶液20μl，37ħ继续孵育4h弃上清，每孔加入DMSO150μl，振荡10min，使结晶物完全溶解。设置空白对照（与实验孔平行，不加细胞只加培养液）。选择490nm波长，酶标仪检测各孔吸光度（A）值。计算细胞生长增殖率。细胞生长增殖率（%）=实验组A值平均值/对照组A值平均值ˑ100%。
四、流式细胞术分析颗粒细胞细胞周期和细胞凋亡
1．流式细胞术分析雄激素作用下颗粒细胞细胞周期：取对数生长期细胞，对照组不予处理；实验组用睾酮（10－5mol/L）作用颗粒细胞48h后，胰酶消化贴壁细胞，离心收集细胞沉淀，用2ml75%冷乙醇悬浮细胞并固定，冻存于－20ħ冰箱中，检测前将细胞密度调整为106个/ml，加入0.5ml PBS，20μl（500μg/ml）碘化丙啶和10μl RNA酶（10mg/ml），于室温下，暗处放置30min后，用流式细胞仪检
测。
2．流式细胞术分析雄激素作用下颗粒细胞早期凋亡：取对数生长期细胞，对照组不予处理；实验组依据MTT结果用睾酮（10－5mol/L）处理颗粒细胞48h，胰酶消化贴壁细胞，离心收集细胞沉淀，按照Annexin V-FITC试剂盒说明书操作，流式细胞仪检测凋亡细胞。
Caspa-3活性检测：通过分光光度法检测试剂盒（Caspa-3Colorimetric Assay Kit）检测。
Realtime PCR检测颗粒细胞中Caspa-3/9、Bcl-2、Bax mRNA水平的表达。
五、总RNA提取与cDNA合成
颗粒细胞接种72h后，细胞生长密度约70% 80%时，设不加药对照组，另设加入睾酮（10－5mol/L）组，继续培养48h，分别提取细胞总RNA；经琼脂糖凝胶电泳，紫外灯下观察，紫外分光光度计测定D260、D280，计算总RNA浓度，逆转录酶MMLV催化合成的cDNA加入灭菌超纯水，－20ħ保存。
六、引物合成
Bcl-2、Bax、Caspa-3/9、GAPDH引物序列如下：Bcl-2：上游引物5'-CAGGTATTGGTGAGTCGGATTG-3'，下游引物5'-TGAAGAGTGAGCCCAGCAGAA-3'，扩增片断长
度为213bp；Bax：上游引物5'-GGCGAATTG-GAGATGAACTG-3'，下游引物5'-CAAAGTAGAAGA GGGCAACCAC-3'，扩增片断长度为158bp；Caspa-3：上游引物5'-ATGGGAGCAAGTCAGTGGAC-3'，下游引物5'-CGTACCAGAGCGAGATGACA-3'，扩增片断长度为136bp；Caspa-9：上游引物5'-GGCGGAGCTCAT-GATGTCTGTG-3'，下游引物5'-TTCCGGTGTGC-CATCTCCATCA-3'，扩增片断长度为268bp；GAPDH：上游引物5'-AGGTTGTCTCCTGCGACTTCA-3'，下游引
物5'-GGGTGGTCCAGGGTTTCTTACT-3'，扩增片断长度为186bp。
七、反应条件
95ħ5min1个循环，95ħ15s，56ħ30s，60ħ1min，40个循环，通过分析溶解曲线比较Ct值得到mRNA的相对水平。
八、统计学分析
各实验至少重复3次，计量数据以均数ʃ标准差（珋xʃs）表示，组间均数比较采用单因素方差分析（ANOVA），两组之间比较采用基于方差分析的多重比较，采用SPSS17.0统计软件完成统计分析，P＜0.05为差异有统计学意义。
结果
1．不同浓度的睾酮对性成熟前小鼠卵巢颗粒细胞活性的影响：图1结果显示，10－5mol/L的睾酮可显著增加颗粒细胞的细胞活性，细胞增殖率在24h、48h、72h分别为（123.45ʃ14.23）%、（143.73ʃ26.51）%、（152.03ʃ28.15）%（与对照组比较，P均＜0.05）；10－6mol/L的睾酮也可增加颗粒细胞的细胞活性，细胞增殖率在24h、48h、72h分别为（107.96ʃ14.51）%（与对照组比较，P＞0.05）、（105.10ʃ21.83）%（与对照组比较，P＞0.05）、（133.67ʃ16.90）%（与对照组比较，P＜0.05）；10－8mol/L的睾酮对颗粒细胞细胞活性无明显作用（P均＞0.05）。结果表明，睾酮对颗粒细胞细胞活性的影响具有时间效应及浓度依赖，10－5mol/L浓度的睾酮作用最明显。
2．睾酮对性成熟前小鼠卵巢颗粒细胞细胞周期和凋亡的影响：睾酮（10－5mol/L）作用颗粒细胞48h后，可促使颗粒细胞细胞周期从G1期向S期过渡（图2）。与对照比较，睾酮（10－5mol/L）处理组的细胞G1期比率［（76.98ʃ2.22）%］下降，S期比率［（7.71ʃ1.90）%］升高（P均＜0.05）。睾酮（10－5mol/L）处理颗粒细胞48h后，细胞凋亡率［（5.72ʃ1.64）%］较对照组［（7.08ʃ1.90）%］下降了1.36%（P＜0.05，图3）。
3．睾酮对颗粒细胞Caspa-3活性的影响：睾酮（10－5mol/L）处理颗粒细胞48h后，Caspa-3活性较对照组下降（P＜0.05，图4）。
4．睾酮对颗粒细胞中多种凋亡因子表达的影响：与对照组相比，睾酮（10－5mol/L）处理颗粒细胞48h 后，细胞凋亡相关因子（Bcl-2、Bax、Caspa-3、Caspa-9）的mRNA表达水平均显著下降（P＜0.05，图5）。
讨论
PCOS多起病于青春期。随着青春期前发生了肾上腺机能初现（adrenarche），继后生殖轴的启动，肾上腺和卵巢来源的雄激素合成增加，形成持续的高雄激素状态［8］。青春期PCOS中，促性腺激素释放激素（GnRH）介导的促黄体生成素（LH）脉冲分泌增加，高水平的LH促进了卵泡膜细胞增生及雄激素分泌过多；增多的雄激素在外周（主要是脂肪组织）转化为雌酮，后者增加了垂体对GnRH的敏感性，促进垂体分泌更多的LH，进而使卵巢分泌更多的雄激素。同时，垂体分泌的卵泡刺激素（FSH）偏低，使卵泡颗粒细胞将雄激素转化为雌激素的芳香化作用削弱，卵泡产生的雌二醇处于早期卵泡水平，导致卵泡发育和成熟障碍［9］。
本文结果显示，较低浓度的睾酮（10－8mol/L）对体外培养性成熟前小鼠卵巢颗粒细胞活性无明显作用；随着浓度升高及处理时间延长，睾酮促进颗粒细胞活性的作用逐渐加强，并且具有浓度的和时间的依赖性。较高浓度（10－5mol/L）睾酮促进了颗粒细胞由G1期向S期转化，并且显著抑制颗粒细胞的早期凋亡，表明较高浓度的雄激素可以不依赖于促性腺激素的作用而刺激颗粒细胞的增殖、抑制其
凋亡。这为探索PCOS卵巢的病理生理机制提供了更多的实验证据。细胞凋亡是卵巢功能自身稳定的一个基本过程，它保证优势卵泡的选择，而颗粒细胞的凋亡与卵泡闭锁关系密切。在动物模型的研究中，有学者提出，PCOS始源于胎儿阶段，通过出生前暴露于高剂量的雄激素可以导致卵巢呈现PCOS特征的发育［10-11］。给予雌性恒河猴或怀孕的母羊以睾酮或双氢睾酮（DHT）处理，可刺激原始卵泡的发生，增加生长卵泡的数量，增加各级卵泡的存活［3，11］。DHT是一种非芳香化的雄激素，在体内不能通过芳香化转化为雌激素发挥作用，在实验中可以用来区分由雌激素受体（ER）或雄激素受体（AR）介导的雌激素或雄激素的作用。出生前睾酮处理的母羊表现出增加的大窦状卵泡（直径7mm），而出生前DHT处理的母羊表现出增加的小窦状卵泡（直径3 4mm），提示雄激素在卵泡起始发育和早期生长中发挥直接作用，雌激素在卵泡发育的晚期阶段和卵泡持续中发挥更主要的作用［12］。
雄激素在体内通过活化AR发挥生物学效应［13］；雄激素作为雌激素的前体，也可以在卵巢局部通过芳香化酶作用转化为雌激素，与ER结合发挥间接的生物学效应［14］。在羊、猪及啮齿类动物的研究中，AR mR-NA和蛋白主要定位于小生长卵泡的颗粒细胞中，但随着卵泡发育成熟其表达逐渐下降［15-17］。在灵长类动物卵巢中，窦前和窦状卵泡的颗粒细胞中的AR表达最高［4，18］，排卵前卵泡中AR表达很低甚至缺失［18］，但用HCG促排卵之后，黄体颗粒细胞中AR mRNA表达又
增加［19］。在人类，AR表达定位于窦前卵泡的卵泡膜细胞、窦状卵泡的颗粒细胞，在优势卵泡的颗
粒细胞和卵泡膜细胞上AR表达显著升高［20］。有研究证实，灵长类卵巢的AR表达与卵泡生长和颗粒细胞增殖成正相关，而与卵泡闭锁和颗粒细胞凋亡成负相关［4］；在牛卵巢中，AR阻断剂可以抑制雄激素刺激的初级卵泡向次级卵泡的发育［21］。这些研究进一步说明了雄激素主要促进早期阶段生长卵泡发育的理论。文献报道，PCOS中的高雄激素抑制卵泡发育早期阶段的颗粒细胞和卵泡膜细胞的凋亡，促进细胞增殖，促进了早期卵泡的发育［2，21］。我们的结果与之一致。但是，也有文献报道，在PCOS患者卵巢中，窦状卵泡期颗粒细胞的凋亡明显增加［22］；在PCOS大鼠模型中，随着卵泡逐渐发育至窦状卵泡阶段，颗粒细胞凋亡逐渐增多，使大多数卵泡停滞在窦状卵泡阶段而不能继续发育成熟［23］。我们综合分析，PCOS中高雄激素对颗粒细胞在卵泡发育的不同阶段可能发挥不同作用，表现为刺激因子和抑制因子的作用。在卵泡发育的早期（始基卵泡和窦前卵泡期），卵泡的发育不受促性腺激素的影响，雄激素可以通过AR直接刺激发育早期阶段卵泡的颗粒细胞增殖、分化，并调整其凋亡过程，促进卵泡的生长发育；窦前卵泡的后期，雄激素刺激颗粒细胞表达更多的FSH受体，FSH诱导颗粒细胞芳香化酶的合成，使雄激素转变为雌激素，雌激素协同促性腺激素进一步促进颗粒细胞发育、分化，促使卵泡形成；但是，随着卵泡发育进入窦卵泡期，PCOS的高雄激素可能抑制FSH刺激的颗粒细胞芳香化酶活性，使雌激素水平下降，同时FSH分泌减少、LH增加，从而卵泡发育、排卵发生障碍，形成多囊样卵巢［9，24］。同时，雄激素过度募集的小卵泡通过卵泡间的相互作用促进颗粒细胞分泌抗苗勒管激素（AMH）等卵泡生长抑制因子，从而抑制卵泡的继续生长［25］。
本文结果还显示，高浓度睾酮作用下，培养的性成熟前小鼠卵巢颗粒细胞的Caspa-3活性下降，凋亡相关的线粒体通路上的信号分子如Bcl-2、Bax、Caspa-3、Caspa-9表达水平下降。目前发现，参与颗粒细胞凋亡调节的信号通路有两条：一是内源性通路，又叫线粒体途径，Bcl-2家族参与；另一条是外源性通路，又叫死亡受体途径，由Fas/FasL/Caspa-8和TNF-α激发，经cAMP传导。两条途径最后均激活了细胞凋亡的下游效应器Caspa-3、6、7等。本文结果表明，高浓度睾酮抑制了颗粒细胞线粒体通路上的诸多凋亡因子，进而抑制了颗粒细胞的凋亡。有趣的是，在我们的研究中，在Bax表达下降的同时，Bcl-2mRNA表达水平也下降。Bcl-2既往被认为是抑凋亡因子，但是近年来许多文献报道，在胸腺细胞或者肿瘤细胞中，某些核受体转录因子（如NR4A1［26］）可以在刺激因子作用下由细胞核转位至线粒体上，与线粒体膜上Bcl-2结合，使其结构发生改变，暴露其BH3结构域，促使Bcl-2由一个抑凋亡因子转变为一个促凋亡因子［27］。
综上所述，在体外实验中，高雄激素通过AR促进性成熟前小鼠早期生长卵泡的颗粒细胞增殖，延长了卵泡生存时期；抑制线粒体通路上相关凋亡因子的表达，发生级联反应，抑制颗粒细胞凋亡。较高的雄激素，可能通过抑制颗粒细胞凋亡导致大批未成熟卵泡的聚集；同时，在窦状卵泡期进一步抑制FS
H刺激的芳香化酶的活性，阻止卵泡最终发育为成熟卵泡。这些结果，为探讨青春期PCOS卵泡增生的发病机制增添了实验依据，也有助于PCOS高雄激素血症的病理生理机制研究。更多深入的机制，有待于进一步的研究。
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（收稿日期：2011-10-17）
（本文编辑：戚红丹）
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