药物研究
猪脑蛋白水解物中小分子肽的制备及生物活性测定
张惠敏 王娅莉 耿亚鹏
作者单位:050015 石家庄市，华北制药集团新药研发公司
摘要 目的 从猪脑中制备不同分子量范围的小分子肽组份，测定各组份的生物活性。方法 (1)猪脑经脱脂、酶解、Sep hadex G -15凝胶过滤制备小分子肽。(2)采用东莨菪碱所致的小鼠记忆获得障碍模型，通过小鼠被动回避跳台实验测定组份的生物活性。结果 (1)得到A1~A5五个小分子肽组份。(2)分别给药A4、A5的两组小鼠潜伏期和错误次数与模型组差异显著(P <0.05)。结论 组份A4、A5具有明显的生物活性，能显著改善记忆获得障碍小鼠的学习记忆能力。
关键词 猪脑蛋白水解物；小分子肽；跳台实验 动物脑蛋白水解物可用于治疗一些脑功能性疾病，近年来人们对其进行了大量研究，并有众多的脑蛋白水解物产品涌入临床，其中奥地利依比威药厂(Ebewe)生产的脑活素注射液已有40年的历史，临床应用最为广泛。国内外众多学者对脑活素的药理活性给予充分的肯定[1,2]。脑活素临床上可用于神经系统疾病特别是阿尔茨海默氏病(AD)的治疗[3-5]，能明显延缓老年痴呆病变的进展，改善痴呆症状。还可用于脑中风、脑震荡、脑损伤、脑动脉硬化、新生儿缺血缺氧性脑病等许多脑部疾病的治疗。
脑活素1989年进入中国市场并以其良好的疗效广泛应用到临床。脑活素是由猪脑蛋白经水解进一步提取制得的生物制剂，含有75%的游离氨基酸和25%的小分子肽。研究表明脑活素的药理作用与其含有的小分子肽类的多种生物活性有关[6]，因此对制备和研究动物脑组织水解物中小分子肽具有重大意义。
1 材料与方法
1.1 材料 猪脑(市场购得)，昆明种小鼠(中国药品生物制品检定所提供),Sephadex G -15(Amersham Bioscience)。
1.2 试药与试剂 酸性蛋白酶(肇东市北方酶制剂有限公司25000U g)，生理盐水(石家庄制药集团有限公司)，氢溴酸东莨菪碱注射液(上海禾丰制药有限公司,0.3mg ml)，其他化学试剂均为分析纯。
1.3 仪器 Waters TM 650E 蛋白纯化系统(Waters 公司),Virtis AD
2.0ES 冻干机(the Virtis Company ),JXDT -1型小动物跳台仪(冀星实验仪器有限公司)。
1.4 方法 (1)小分子肽的制备：新鲜猪脑去膜、去血管，洗净后切成小块，放入索氏提取器内，用丙酮回流12h 后，取出压碎晾干，再用丙酮回流12h，所得固形物再用乙醚按上法回流提取共24h，晾干后即得到猪脑脱脂蛋白粉。猪脑脱脂蛋白粉与5倍的水混合，加入猪脑脱脂蛋白粉重量2%的酸性蛋白酶，
混匀后用冰醋酸调p H 值至
2.00 0.05,50 连续水解36h，并保持pH 值在2.0~4.0，过滤，滤液50 减压蒸干后，分别用石油醚和无水乙醇搅拌24h，抽滤，滤饼真空干燥即得猪脑蛋白水解物。水解产物用Sephadex G -15凝胶柱，以0.9%NaCl 为洗脱液进行分离纯化，分段收集各流份并脱盐，冷冻干燥后即可得到不同分子量范围的小分子肽组份。(2)对小鼠学习记忆的影
响：取小鼠70只，体重19~21g，雌雄兼用，随机分成7组，每组10只。正常对照组和模型对照组均腹腔注射生理盐水，其余5组分别按剂量150mg kg 腹腔注射所制得的样品。连续注射7d，每天1次。末次给药30min 后，除正常对照组腹腔注射生理盐水外，其余6组按剂量3mg kg 腹腔注射氢溴酸东莨菪碱注射液。30min 后在跳台仪中训练测试。先让小鼠熟悉跳台仪环境3min，然后通以36V 电压，小鼠受到电击后会跳上跳台逃避。跳下时以小鼠双足同时接触铜栅为触电，视为错误反应。训练5min，观察和记录小鼠跳上跳台的时间和5min 内的错误次数作为学习指标。24h 后重作测试，测时先将小鼠放置在跳台上，同时开动秒表记录小鼠第1次跳下的时间，此为触电潜伏期，同时记录5min 内跳下跳台次数(错误次数)，若5min 内小鼠没有从跳台上跳下，则潜伏期记为300s，错误次数记为0，潜伏期和错误次数作为记忆指标。训练和测试均在下午同一时间内进行，各组动物交叉进行[7]。1 5 统计学处理 测定数据以 x s 表示，采用t 检验统计处理。P <0.05为差异有显著性。2 结果与讨论
2.1 脱脂蛋白粉及酶解产物的收率 1800g 新鲜猪脑共制得脱脂蛋白粉67g，收率为
yu拼音3.7%。脱脂蛋白粉的酶解收率为31.2%。经过凝胶过滤共收集到5个组份，此步的收率为9
4.5%。直接用去离子水洗脱，可以省去脱盐步骤，操作简单，但是用去离子水洗脱只收集到4个组份，且收率仅为79.4%，这可能与用纯水洗脱时,Sephadex 凝胶对某些蛋白的非特异性吸附有关，因此本实验采用0.9%NaCl 溶液洗脱。
2.2 对小鼠学习记忆影响的测定结果 对各组动物的触电潜伏期和错误次数进行t 检验，结果表明模型对照组与空白对照组比较，潜伏期明显缩短,5min 内错误次数明显增加(P <0.01)，说明所造的记忆获得障碍模型成功，见表1。
表1 跳台实验结果
n =10, x s
组别潜伏期(S)
5min 内的错误次数空白对照组 194.6
103.5 1.1 1.1模型对照组37.4 41.4** 3.1 1.8**A1组103.2 111.2 2.1 1.5A2组69.9 85.9 2.1 1.2A3组152.2 118.4 3.1 3.2A4组136.1 102.5 1.3 0.8 A5组
173.8 116.0
1.
0 0.8
注：与空白对照组比较,
*
P <0.05,*
*刻苦的反义词
P <0.01；与模型对照组比较,
P <
0.05,
P
<0.01
A1、A2组与模型对照组比较，潜伏期和5min内的错误次数差异均无显著性(P>0.05)，这说明组份A1、A2不具有显著的学习和记忆改善作用。A3组与模型对照组比较，潜伏期明显延长(P<0.05)，但错误次数没有显著减少(P>0.05)，这一结果表明组份A3学习和记忆改善作用尚不能肯定。A4、A5组与模型对照组比较，潜伏期明显延长(P<0.05,P<0.01)，错误次数显著减少(P<0.05,P<0.01)，说明其能明显增强记忆障碍小鼠的学习记忆能力。虽然A1和A2组与对照组差异无显著性，但两组的潜伏期均有所延长,5min内的错误次数均有所减少。
本文以新鲜健康猪脑为原料，采用酸性蛋白酶水解,Sepha-dex G-15凝胶过滤方法对酶解产物进行分离纯化，得到5个小分子肽组份，并对其生物活性进行测定，这对进一步研究小分子肽的结构以及临床用药的质量控制都有积极意义。
参考文献
1 Koroleva VI,Korolev OS,Mares V,et al.Hippocampal damage i nduced by
carbon monoxide poisoni ng and spreading depressi on i s alleviated by chronic
treatment with brain derived polypeptides.Brai n Res,1999,816:618-627.人生感悟
马演初
2 Ruben JB,Dafang Wu,Manfred W.In vivo upregulation of the bl ood-brain
barrier GLUT1gl uco transporter by brain-derived peptides.Neurosci Res, 1999,34:217-224.
3 Ruether E,Moes sler H,Windisch M.The MAD-B study-A randomi zed double-
弃旧图新blind placebo-controlled trial with cerebrolysin i n Alzeimer s dia.Eur Neuropsyc hopharm,2000,10:S355.迟钝的近义词
4 Rai ner M,Moessler H.Cerebrol ys in i n the treatment lf dementia:Open-l abel
study wi th a neurotrophic agent.Eur Neuropsychopharm,2000,10:S355-S356.
5 Ruether E,Gmei nbauer R,Windisch M.Follow-up inves ti gation i n patients
wi th Alz hei mer s di as e24weeks after termination of cerebrol ysi n therapy.
Eur Neuropsychopharm,2000,10:S357-S358.
6 Hartbauer M,Hutter-Paiter B,Skofi tsch G,et al.Antiapoptotic effects of the
peptidergic drug Cerebrol ysi n on pri mary cultures of e mbryonic chick cortical neurons.J Neural Trans m,2001,108:459-473.
7 Makoto U,Tetsuya K,Norihiro S,et al.Dynorphi n A-(1-13)potently i mproves
s copola mine-i nduced impairment of passi ve avoi dance respons e in mice.Eur J Pharmacol,1995,274:89-93.
短篇报道
宫腔填塞纱布条治疗剖宫产出血疗效观察贾苒 廖更新 周玉环 张艳芹
产后出血是产科严重并发症，为产妇死亡的主要原因之一。近年来，我院对剖宫产出血采用宫腔填塞纱布方法可迅速达到止血目的，保留子宫，减少感染，收到良好的效果，现报道如下。
1 资料与方法
1 1 一般资料 2001年1月至2005年1月我院应用宫腔填塞纱布治疗剖宫产出血96例，其中子宫收缩乏力81例，前置胎盘13例，胎盘早剥2例。孕妇年龄23~35岁。手术采用持续硬膜外麻醉，手术方法均为子宫下段剖宫产术，术中使用催产素40 U，同时按摩子宫，静脉应用止血药物,1例行双侧子宫动脉结扎术，均采用宫腔填塞纱布取得成功。
1 2 方法 子宫收缩乏力应用催产素40U同时徒手持续按摩子宫无效，出血量多，或持续出血不止者，立即给予宫腔填塞纱布条。取宽8cm高压灭菌绷带2卷，于顶端相接重叠，用卵圆钳夹住，沿宫底部自右向左来回折叠填塞，压紧纱条，吸净积血，另一端用卵圆钳送至阴道，继续填塞纱条至子宫下段，使整个宫腔填紧填满，如填塞完毕有剩余可剪断，不足可续接。观察无活动性出血，可吸收线缝合子宫切口，注意避开纱条。术后给予抗生素治疗，选用青霉素、先锋霉素或红霉素治疗5d。纱条放置24h后，给予催产素20U静脉滴注，常规消毒外阴后自阴道提出。
2 结果
96例中,1例因并发DIC行子宫切除术,95例宫腔填塞纱作者单位:272100 山东省济宁市，济宁医学院附属医院妇产科布后立即止血,24h后抽出纱布条，子宫收缩好，无明显阴道流血，抗生素治疗5d,3~4d后体温恢复正常,5~7d拆线出院，无1例发生感染及晚期产后出血。42~60d随访，子宫复旧好，恶露干净，妇科检查正常。电气运行
3 讨论
宫腔填塞纱布是一种传统的治疗产科出血的方法，近年文献报道较多[1,2]。对产后出血及产后有出血倾向的患者，缩宫素、止血药物治疗无明显效果，应用宫腔填塞纱布均取得良好效果，宫腔纱布填塞用物理方法局部压迫胎盘剥离面及子宫肌壁间血管，达到止血目的。
彼此近义词3 1 用双层无菌绷带折叠填塞宫腔，容易迅速填满，止血效果好，打结少，易抽出，操作简便，不需要特殊设备，能有效减少孕妇出血量，保留子宫，生育功能不受影响，减少孕妇痛苦及费用，适合于各级医院。
3 2 宫腔填塞纱布时间越早越好，应用催产素无效，子宫收缩无好转，及时填塞纱布条，可减少出血，避免产后出血及并发症发生。对可能发生出血倾向者，可预防性填塞纱布。
3 3 宫腔填塞纱布一定要紧密，并注意观察宫腔出血，对于宫腔填塞纱布后仍持续出血者，改行结扎子宫血管或手术治疗。对于急性失血并发DIC的患者，药物综合治疗同时，分别行子宫全切或次全子宫切除术。
参考文献
1 胡亚莉，周重宛，金溶溶，等 子宫腔纱布填塞术在控制剖宫产出血
中的应用 中华妇产科杂志,1998,33:43-45
2 刘桂英，佟静 宫腔纱布条治疗剖宫产手术中大出血68例分析 中
国实用妇科与产科杂志,1999,15:569
