综述干眼病临床发病机制及与动物模型的相关性研究进展
宋硕u，王若男h2，谢金华u，孟永3，熊亚妮2，钱仪敏2，李华2'3*
(1.中国医药工业研究总院国家上海新药安全评价研究中心，上海201203: 2.上海益诺思生物技术股份有限公u+j，上海201203;
3.益诺思生物技术南通有限公司，江苏南通226133)
摘要：干眼病（dry eye dia, D ED)是一种多因素的眼表疾病，其发病机制复杂，发病率逐年升高，临床上只能针对症状 进行缓解，严重影响患者生活质量。本文介绍了D ED的多种病因、发病机制和目前常见的动物模型，并重点介绍了动物模 型与临床DED发病机制的相关性，以期为DED动物模型的发展和改进提供思路。
关键词：干眼病；病因：发病机制：动物模型
中图分类号：R749.3; R971_'.41 文献标志码： A 文章编号：1672-9丨88(2021)04-0296-07
DOI：10.136B3/j.wph.2021.04.012
Rearch progress on the clinical pathogenesis of
dry eye dia and its correlation with animal models
SONG Shuo1'2, WANG Ruonan12, XIE Jinhua1'2, MENG Yong3, XIONG Yani2, QIAN Yitnin2, LI Hua2'3*
(1. National Shanghai Center f or New Drug Safety Evaluation and Rearch o f C hina State Institute o f P harmaceutical Industry,
Shunghai 201203, China; 2. Shanghai InnoStar Bio-tech Co., Ltd., Shanghai 201203, China;
古代形容女子美貌的词3. IimoStar Bio-tech Nantong Co., Ltd., Nantong 226133, Jiangsu Province, China)
Abstract: Dry eye dia (DED) is a multi-factor ocular surface dia with complex pathogenesis and an increasing incidence rate. Clinical treatment can only relieve symptoms, which riously affects the quality of patients' life . This paper introduces etiologies, pathogenesis and animal models of DED, and focus on the correlation between animal models and clinical pathogenesis of DED, in order to provide ideas for the development and improvement of DED animal models.
Key words:dry eye; cau of dia; pathogenesis; animal models
干眼又称“角结膜干燥症”，是指任何原因引起 的泪液质和量异常或动力学异常导致的泪膜稳定性 下降，并伴有眼部不适，导致眼表组织病变为特征 的多种疾病的总称，包括干眼症、干眼病（dry eye dia,DED)和干眼综合征。部分人群具有干眼的 症状但为一过性，休息或短暂应用人工泪液则恢复 正常，且无干眼的各种体征和眼表的损害，亦无引
收稿日期2020-11-12
作者简介：朱硕，硕十研宂生，研究方向：药物眼科毒理研究。
通信作者：李华，博士，研宄员，研宄方向：药物毒理研究。
基金项目：十五国家“重大新药创制”科技重大专项(20丨8Z X0920丨0 1 7-008)；上海市科委研发平台专项上海市科委(18DZ2290100)起干眼的局部和全身性原因，这类情况称为干眼症。既有症状又有体征者则称为DED：合并全身免疫性 疾病者则为干眼综合征m。目前临床前干眼研宄所 用的动物模型都为DED模型，且临床上主动接受治 疗的干眼患者大多都是DED患者，因此本文仅介绍 DED。
2017年国际泪膜与眼表协会国际干眼指南II (Tear Film and Ocular Surface Society International Dry Eye Workshop I I,TFOS DEWS II )中将干眼定义为“一种眼表的多因素疾病，其特征在于泪膜的稳态失 调，并伴有眼部症状，其中泪膜不稳定和泪液高渗 性、眼表炎症和损害以及神经感觉异常发挥病因作
I2 S 1
VoU2 No.4
用”气D r o最常见的症状是眼疲劳、异物感、干涩 感，其他症状有烧灼感、眼胀感、眼痛、畏光、眼红等。随着空气污染加重及视频终端长时间使用等因素的 影响，D E D的发病率逐年升高。流行病学调查发现，D ED在50岁以上成人中的患病率为11.3%，而在 75岁以上女性中的患病率高达22.8%，由此可以预 测D E D的发病率将随着人口老龄化而继续升高[3]。
D E D的临床前研究主要依赖动物模型，其类型十分 广泛，制备方法也比较多。但如何基于DED的临床 特点，制备与人体D E D发病机制和临床表现均一 致的动物模型，仍是目前研宄的重点和难点。因此，本文就D E D的病因、发病机制和动物模型，以及动 物模型与临床发病机制之间的相关性作出综述。
1DED的分类
DED的分类标准尚未统一，参照Labetoulle 等W通过德尔菲法对DED症状和体征的分类，以及DEWS I I和《中国干眼专家共识：定义和分类 (2020年）》中对D ED的分类[2’51，同时为了便于描 述和理解，在这里将DED分为（水液性）泪液不足 型干眼（aqueous tear deficient dry eye,ADDE)、蒸 发型
干眼（evaporative dry eye,EDE)和混合型干眼。ADDE由泪腺炎症或阻塞、屈光手术或隐形眼镜、局部或全身性药物等医源性疾病引起，表现为泪液 生成不足，又可分为干燥综合征（sjogren syndrome, SS)及非S S所致的DED。E D E由睑板腺功能障碍 (meibomian gland dysfunction，MGD)和脂质分泌减 少引起，表现为泪液蒸发过强。其中EDE发病率最高，约35.8%〜58%，其次是混合型干眼（25.4%〜30.5%) 和 ADDE(3.5% 〜10.3%)⑷。2 DED的病因和发病机制
2.1病因
D E D的病因十分复杂，存在多种致病因素。如 视频终端的过度使用、环境污染、全身性疾病、眼 局部炎症、眼部手术以及药物的使用等，都是导致 D E D的潜在危险因素。D E D的病因通常大致分为：环境因素、泪液不足或泪液蒸发过强三类[6]，详见 表1。
2.2发病机制
2.2.1眼表炎症
环境因素、感染、内源性应激、遗传因素等导 致的眼表应激是眼表炎症发生的主要机制。促炎细 胞因子、趋化因子及其受体和基质金属蛋白酶导致 辅助性T细胞大量激活、增殖，浸润眼表和泪腺[7]，导致眼表损伤和炎症。
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D E D的炎症反应成分包括炎症细胞和炎症介质。炎症细胞主要是抗原呈递细胞，包括淋巴细胞、树 突状细胞和辅助性T细胞等，还包括角膜和结膜的 上皮细胞。炎症介质包括炎性细胞因子、趋化因子 及其受体、基质金属蛋白酶和分泌性磷脂酶等，泪 液中细胞因子水平可作为D E D的生物标志物，用于
D ED程度的分类、机制阐明和治疗效果评估[8]。
2.2.2泪膜不稳定和泪液渗透压增高
健康人的泪膜含有脂质、水、蛋白质、电解质 和维生素等成分[9]。泪膜的精确结构尚无定论，一 般认为泪膜分为3个部分：最表面是由睑板腺分泌 的脂质层，稳定和润滑眼球表面，减少泪液蒸发；中间水样层由泪腺和副泪腺分泌，占泪膜厚度的 90%；最内层是结膜杯状细胞、结膜和角膜上皮共同
表1DED的主要病因
Table 1The main pathogeny of DED
类别病因
环境因素内部因素：年龄增长、雄激素缺乏、慢性疾病和自身免疫病等；外部因素：系统性药物、眼科药物、低湿、多风环境等泪液不足SS、非s s(泪腺先天异常或阻塞、反射性泪腺分泌不足等）
泪液蒸发过强睑板腺功能或眼睑闭合障碍、瞬0率低、防腐剂使用过多、维生素A缺乏、长期使用隐形眼镜、过敏性结膜炎等2021 V O U 2Z 0.4
分泌的黏蛋白层，含多种糖蛋白[H)1。泪膜的任何一 层出现异常都会造成泪膜不稳定，如泪腺、睑板腺 和结膜杯状细胞，可产生泪液，润滑眼睛，清除污垢，保持眼部健康；脂质、水分或黏液分泌出现问题或 泪膜水分蒸发增加，均可导致DED，且通常由上述 多个因素引起|9]。
泪液稳态是由眼表（角膜、结膜和睑板腺）、泪 腺以及它们之间的神经连接共同组成的泪腺功能单位 (lacrimal functional unit,LFU)反射调控实现的，可调节泪液的产生，使泪液渗透压始终保持在狭窄的 正常范围内[n]。泪液减少或泪膜破裂导致泪液高渗，通过一系列炎症反应损伤眼表。高渗性炎症环境导致 角膜和结膜上皮细胞和杯状细胞凋亡，进一步导致泪 膜不稳定。同时，泪膜不稳定和高渗性引起的炎症进 一步导致神经源性慢性炎症，加重DED121。
2.2.3神经感觉异常
正常的眼表神经对维持眼部微环境稳态起着重 要作用。角膜上存在3种不同功能类型的感觉神经 元，包括多态伤害感受器神经元、冷觉感受器神经 元及机械伤害感受器神经元。其可根据眼表微环境 的变化，反馈调节眨眼反射振幅和速度、泪液渗透 压、泪膜厚度、眼表温度，维持眼表微环境稳态[13]。因此，眼表神经反馈回路的损伤，将导致眼表神经 感觉异常、眼表微环境改变，进而诱发DED.
同时 LFU的受损及其神经支配更加剧了 DED。例如激光 视力矫正术时角膜神经被切断而导致神经功能异常，或伴有纤维肌痛症或偏头痛等感觉障碍的患者可出 现D ED的症状和体征[14]。
2.2.4性激素水平失调
雄激素、雌激素和孕激素等性激素受体在睑板 腺、角膜、结膜和视网膜色素上皮中均有表达。性 激素通过改变杯状细胞密度，以及泪液的产生和质 量来影响眼表微环境稳态[15]。例如雄激素通过雄激 素受体影响睑板腺功能，刺激睑板腺合成和分泌脂 质，抑制相关角化基因表达。绝经、衰老、自身免 疫性疾病及抗雄激素药物的使用等引起雄激素缺乏，均可能引起D ED161。雄激素水平下降，导致MGD，使得泪膜中脂质成分减少，泪膜破裂时间缩短，形 成EDE；还可导致泪腺上皮细胞萎缩，泪液分泌减 少，形成ADDE；眼表微环境改变刺激泪腺腺泡细 胞表达自身抗原，引起自身免疫性炎症反应，泪腺 上皮细胞凋亡、坏死，泪腺萎缩，形成恶性循环[17]。
2.2.5细胞凋亡
泪腺细胞、结膜上皮细胞、角膜上皮和内皮细 胞的凋亡与D ED的发生密切相关，Caspa家族蛋 白（Cysteine aspartic acid specific protea)、p53 蛋白 和 B淋巴细胞瘤-2 基因（B-cell lymphoma-2, Bcl-2)家族蛋白等均参与引起DED的细胞凋亡的信号转 导过程。眼表细胞发生凋亡，而眼表局部组织中淋 巴细胞的凋亡却受到抑制，导致淋巴细胞增多而加 重炎症反应[181。同时，泪液和眼表的促凋亡
因子水 平升高，激活多条凋亡通路，加剧细胞凋亡。例如 DED 发生时，Caspa-8 和 Y干扰素（interferon-y, IFN-丫）通过双重凋亡途径，共同诱导、加重结膜细 胞凋亡[191。高山族节日
3 DED动物模型
根据D ED的分类方式，也可以将其动物模型分 为ADDE动物模型、ED E动物模型和混合型DED 动物模型。主要通过手术干预、药物（或化学物质）干预、内源性物质缺乏、诱导疾病状态以及多种诱 导方法组合等方式来建立。
3.1ADDE动物模型
3.1.1模拟 SS
S S是一种慢性自身免疫性疾病，影响外分泌腺 的分泌功能，尤其是泪腺和唾液腺，导致DED和口 干，对其他器官和系统也有影响。眼部症状包括角 膜及结膜的炎症，影响泪液分泌，引起眼表炎症或 干燥性角结膜炎。年龄、病程和性别会影响S S的发 生，其中年龄是最大的风险因素，因此建立S S动物 模型通常使用周龄较大的动物™。例如，非肥胖糖 尿病（non-obe diabetic,NOD)小鼠的一种突变品 系>«3〇.810.^121>在10周龄表现为轻度SS，但在1
| 2021 Vol.42 Z0.4
岁时发展为严重的泪腺炎和DED™。杨丽媛等[22]通过耳缘静脉注射体外活化的自体外周血淋巴细胞，以诱发自身免疫性泪腺炎，2周后家兔出现了类似于 S S患者的自身免疫性DED症状。
3.1.2手术干预
手术干预主要通过摘除泪腺、阻断或干扰神经 等方式来建立ADDE动物模型。Shinomiya等[23]通 过摘除C57BL/6小鼠眶外和眶内泪腺，成功建立了 ADDE小鼠模型。与仅切除眶外泪腺相比，泪液减 少更明显，仅为假手术组泪液量的53%，在整个10 周的术后观察期间，泪液持续减少无改善。术后各 时间点角膜损伤更严重，术后12周组织病理学检查 仍检测到角膜、结膜和睑板腺的炎症性改变。然而，摘除泪腺诱导ADDE模型的成功率相对较低，而且 通过手术仅摘除动物的主泪腺有时并不能引起明显 的眼表干眼症状和体征，可能与泪腺摘除不千净和 泪液的代偿性产生有关。
正常生理状况下，眼表和泪腺等组织中的神经 反射环路调控泪液分泌功能，其中任一环节出现异 常，都会导致分泌功能出现障碍[1°]。因此可以通过 手术阻断或干扰动物的神经环路，减少泪液、黏蛋 白和脂质的产生，建立ADDE动物模型。Toshida 等[24]在家兔内耳切除5 m m长岩浅大神经，未损伤 眼球或眼眶组织。术前及术后7 d，对所有家兔进 行DED症状和体征检查，结果显示，岩浅大神经 的部分缺失导致了至少持续1周的家兔DED快速 发作。
3.1.3药物干预
药物干预是通过全身或局部使用特定药物，人 为创造ADDE的病因（使泪液生成不足），建立 ADDE动物模型。东莨宕碱（scopolamine)是M胆 碱受体阻断药，可以阻断乙酰胆碱（acetylcholine)的作用，抑制泪液和黏蛋白分泌，导致DED形成。Cheon等[25]通过吸入和皮下注射的方式给予雌性C57BL/6小鼠东莨菪碱，成功建立了 ADDE模型，小鼠表现为泪膜破裂时间缩短、角膜荧光素染色评分增加。眼局部给药，作用直接，可以较快地诱导
形成ADDE模型，但模型维持稳定状态的时间长短
不一，与局部诱导给药的时间长短有关。
3.2 EDE动物模型
3.2.1手术干预
当前手术干预制备EDE动物模型的方法仍然较
少，主要通过手术致M GD和机械阻止瞬目来制备。
睑板腺位于上眼睑和下眼睑，开口于睑缘，在
眼表面分泌脂质，形成泪膜的最外层，防止水分蒸发,
促进泪膜稳定。MGD是一种慢性弥漫性睑板腺异常,
表现为终末导管梗阻或脂质的定性或定量改变，可
能导致泪膜改变和眼刺激症状，临床上表现为明显
的炎症和眼表疾病。灼烧睑板腺开口可以闭塞睑板
腺、阻塞腺体口，导致中央导管和导管扩张以及导
管壁上皮变薄，脂质、黏蛋白分泌减少，泪液中的
水分蒸发增加，使泪液渗透压升高而引起炎症[26]。Nichols等[27]用改良的小血管烧灼器灼烧小鼠睑板
腺孔，分别在治疗后1h、1周、4周、8周和12周时，假槟榔树
对眼睑进行组织学检查。发现在烧灼后12周，睑板
腺导管从轻度充血到形成大囊肿，腺体大量脱落且
产生凝固的“干酪样”物质。睑板腺开口阻塞最终
导致睑板腺腺体形态改变，表现出临床上M GD的腺
体脱落特征。该模型可用于研宄导致ED E的进行性
因素和治疗药物。
一般通过机械性方法减少瞬目频率来建立机械
阻止瞬目致EDE动物模型。该模型泪腺功能正常,
但泪液无法到达眼表，泪液中黏蛋白缺乏，泪液蒸
发过快，使泪液渗透压增高和角膜组织脱水，眼表
组织干燥失活，角膜上皮细胞坏死缺损，引起角膜
上皮屏障功能损害。造模所需周期短，并且与人类
临床DED症状有一定相似性。刘盛春等[28]用铁夹
固定兔眼睑，将其瞬目频率减少为实验前的1/3、每
天8 h，成功建立了 ED E兔干眼模型。结果显示，
角膜荧光素染色评分显著升高，泪膜破裂时间显著
减少且随着时间推移逐渐加重，结膜杯状细胞减少,
角结膜上皮层以增生性改变为主，泪腺组织无明显
2021
V01.42
泥塑图片N0.4
变化。
3.2.2特定化合物干预
苯扎氯铵（benzalkonium chloride)被广泛用作滴眼液的消毒剂和防腐剂，中长期应用会对眼表产 生毒性，引起炎症和角膜神经损伤而导致DED1291。Zhang等[3Q|局部滴眼给予BALB/c小鼠0.25%、5 nl 的苯扎氯铵溶液，早晚各滴i次，连续使用7 d，成 功建立了小鼠ED E模型。然后，滴眼给予小鼠维销售培训总结
生素A微乳，治疗7 d。结果发现，维生素A能有 效抑制苯扎氯铵引起的泪液分泌减少，增强泪膜稳 定性；抑制角膜上皮细胞中凋亡相关基因（B ax和 Bcl-2)及其调控的蛋白表达，减少角膜上皮细胞凋 亡。因此，也可以通过调整饮食结构，使动物体内 内源性维生素A缺乏，诱导建立EDE动物模型。
细胞外渗透压升高引起的高渗应激会严重影响 多种组织中的正常细胞功能。泪膜高渗透性可能导致 角膜上皮病理改变，进一步诱发干眼。因此可以通过 眼表局部给予高渗溶液，人为制造眼表高渗环境，建 立EDE动物模型。Huo等[3n用500 mOs mol/L氯化 钠溶液滴眼处理BALB/c小鼠，每天5次，持续28 d，成功建立了 ED E小鼠模型。该小鼠表现为泪液渗透 压增高，杯状细胞减少，角膜荧光素染色评分及角 膜上皮厚度增加。
3.3混合型DED动物模型
3.3.1性激素水平失调
歌唱祖国教案性激素水平失调，尤其是雄激素水平的降低，会导致睑板腺和泪腺上皮细胞萎缩，分泌功能受 损，是混合型DED重要的发病机制[|6]。因此混合 型DED动物模型可以通过去势手术，如摘除动物的 睾丸或卵巢来诱导。雄激素水平降低可致MGD，脂 质分泌减少；泪腺上皮细胞萎缩，水样层分泌减少；杯状细胞密度降低，黏蛋白分泌减少[15_17]。而脂质 和黏蛋白的减少又均可导致水样层蒸发过强。泪膜 各层均变薄，导致混合型DED。L i等1321切除健康 成年雄性BALB/c小鼠睾丸，在多个时间点评估
泪 液产生、泪液破裂时间和角膜荧光素染色。在睾丸切除小鼠中，观察到泪液分泌减少、泪膜破裂时间短、角膜染色持续以及角膜上皮结构改变。接受睾丸切 除术的小鼠可以用来建立混合型DED模型，且外 源性雄激素的补充可以改善其角膜上皮结构和泪膜 功能。去势诱导DED动物模型的方法简单易行，与年长人群的干眼临床表现也较为符合。此外，也可 以通过药物来改变性激素水平，使性激素水平失调。例如，抗雄激素药物非那雄胺（finasteride)可抑制睾 酮转化为作用更强的二氢睾酮，降低组织中二氢睾 酮水平。大鼠灌胃给予非那雄胺，建立非那雄胺诱 导的雄激素缺乏千眼模型，评估眼表状态和泪腺炎 性细胞因子的表达，结果显示非那雄胺引起明显的 泪腺缺损和炎性细胞浸润[33]。
3.3.2组合方法
混合型D ED动物模型同时具有ADDE和EDE 的病因和表现，因此可以将上述建立ADDE和EDE 动物模型的方法组合，或结合诱导干眼发生的环境 危险因素共同作用，来建立混合型DED动物模型。例如，东莨菪碱联合低湿环境诱导小鼠混合型DED 模型。C57BL/6J小鼠皮下注射氢溴酸东莨菪碱，并 放置在相对湿度为30%的环境控制室中，成功诱导 出了小鼠混合型DED模型[341。混合型DED动物模 型的建立，以组合的方式将现阶段单因素动物模型 联系起来，利用多因素造模方法，建立复合动物模 型，相对于ADDE和ED E动物模型更加符合临床上 DED的发生。
4动物模型与临床发病机制的相关性
DED的发病机制相当复杂，根据不同病因可诱 导不同类型的DED动物模型，但目前尚无一种动物 模型能准确模拟DED频繁发生、逐渐恶化、机制复 杂的特点。由上可见，当前动物模型可以模拟部分 人体发病机制，己成为D ED药物筛选和临床前体内 试验研宄的重要工具。
洋务运动代表人物有同时也存在很多不足，亟待改进。其中最重 要的一个问题是阐明M GD与D ED的关系，以及 MGD动物模型的建立。D ED和MGD 密切相关，它
