【摘要】 目的 检测胃癌组织内差异表达的长链非编码RNA （long non-coding RNA ，lncRNA ）的表达情况，探寻新的胃癌标志物。方法 选取5对胃癌患者的癌组织及其配对癌旁正常胃黏膜组织标本，应用人类lncRNA 芯片进行筛查，分析差异表达的lncRNA 谱，综合评判选定目标lncRNA ，再扩大样本量行实时荧光定量聚合酶链反应检测，分析其表达量与胃癌临床参数的相关性。结果 芯片筛查发现5445个差异表达的lncRNA 。lncRNA p2819在胃癌组织中的相对表达量显著低于癌旁正常组织（P ＜0.05），且lncRNA p2819的相对表达量与胃癌分化程度、TNM 分期均呈负相关（均P ＜0.05），而与性别、年龄、肿瘤位置、肿瘤最大直径等均无显著相关性（均P ＞0.05）。结论 胃癌组织中lncRNA p2819表达下调，其表达量与胃癌恶性程度、TNM 分期呈显著负相关，可作为胃癌的潜在标志物。【关键词】 胃癌；长链非编码RNA ；lncRNA p2819；肿瘤标志物
Differential expression of long non-coding RNA p2819 in gastric cancer and its clinical significance
Shi Hongzhi, Dabu Xilite, Gao Hongkai, Miao Shan, Liu Xinwei (Department of General Surgery, the Third Medical Center of PLA General Hospital, Beijing 100039, China)
Correspondingauthor:GaoHongkai,E-mail:***************
【Abstract 】 Objective To investigate long non-coding RNA (lncRNA) expression profile in gastric cancer tissue and to identify new biomarker for gastric cancer. Method The expression profile of lncRN
A were detected in 5 paired gastric cancer and adjacent normal tissues by microarray. The target lncRNA was lected by comprehensive analysis and judgement. The expression was reassd by quantitative rever transcription-polymera chain reaction (qRT-PCR) test in an incread sample volume. The association between the expression of target lncRNA and clinical features were analyzed. Result Five thousand four hundred and forty five differentially expresd lncRNAs were found by microarray. The relative expression of lncRNA p2819 was significantly down regulated in gastric cancer tissues than tho in paired adjacent tissues (P ＜0.05). The relative expression of lncRNA p2819 is negatively correlated with the malignancy of gastric cancer and its TNM staging (all P ＜0.05), but has no significant correlation with gender, age, tumor location and tumor maximum diameter (all P ＞0.05). Conclusion The expression of lncRNA p2819 was down regulated in gastric cancer tissue, and its expression is negatively correlated with the malignancy of gastric cancer and TNM staging. LncRNA p2819 may rve as a potential new biomarker of gastric cancer.
【Key words 】 Gastric cancer; Long non-coding RNA; LncRNA p2819; Biomarker
长链非编码RNA p2819在胃癌组织中的差异表达及其意义
我的评价史宏志，达布西力特，高宏凯，苗山，刘昕炜（解放军总医院第三医学中心 普通外科，北京 100039）
基金项目：原武警总医院院级课题（WZ2015016）涉外旅游
通信作者：高宏凯 E-mail ：***************
胃癌是全球最常见的恶性肿瘤之一，是发展中国家成人排名第三位的癌性致死因素[1]。早期胃癌症状隐匿、检出率低，患者就诊时多已为进展期，因此往往生存率低、复发率高、预后较差。研究胃癌的分子机制、探寻早期诊断标志物或分子治疗靶点，是提高胃癌总体诊治水平的关键。
目前人类基因组计划已破译约2.5万个基因信
息，其中仅有约2%的基因可编码蛋白，大量基因不编码蛋白，即非编码RNA ，其中序列长度＞200 bp 的非编码RNA 称为长链非编码RNA （long non-coding RNA ，lncRNA ）。越来越多的研究发现，lncRNA 在基因转录、翻译和表观遗传等多层面参与生命活动调控，与包括肿瘤在内的多种疾病相关[2]。近几年，有研究证实，lncRNA 的异常表达与胃癌生物学行
DOI ：10.12151/JMCM.2021.01-09
为密切相关，针对lncRNA的分子机制研究已经成为胃癌领域的研究新热点[3-7]。
现有研究表明，胃癌相关的lncRNA数量众多、功能多样，还有更多有价值的lncRNA有待发现和验证。
本研究旨在通过高效能基因芯片筛查胃癌组织与癌旁正常组织中差异表达的lncRNA，从中寻找与胃癌生物学特征相关的新标志物，选定目标lncRNA，通过扩大样本行实时荧光定量聚合酶链反应（quantitative real-time polymera chain reac t ion，qRT-PCR）实验验证后，再分析其与胃癌临床参数的相关性，现报道如下。
1 资料与方法
1.1 一般资料和组织样本选取2014年6月至2015年10月解放军总医院收治的72例胃癌患者为研究对象，其中男49例，女23例；年龄30～83岁，中位年龄60岁；肿瘤部位：胃窦部37例，胃体23例，贲门12例；最大直径：＞5 cm的22例，＜5 cm的50例；TNM分期：Ⅰ期7例，Ⅱ期26例，Ⅲ期36例，Ⅳ期3例，术后病理提示中高分化20例，低分化52例。TNM分期参照2010年国际抗癌联盟和美国癌症联合会第七版分期标准。纳入标准：①胃癌病理诊断明确，且无远处转移；②未经放疗和化疗；③未同时合并其他恶性肿瘤。标本获取：胃癌组织及其5 cm以外正常胃黏膜组织（均为约0.5 cm组织块）离体10～30 min内取材，液氮低温保存。
勇敢女孩1.2 lncRNA芯片筛查实验术后随机选取5对胃癌组织及配对正常胃黏膜组织标本，应用博奥晶芯lncRNA＋mRNA Human Gene Expression Micr-oarray V4.0，4x180K芯片（博奥生物有限公司）进行芯片筛查检测。组织标本低温研末，步骤如下：①采用Trizol试剂（美国Invitrogen公司）提取组织
块中总RNA并质检。采用NucleoSpin® RNA clean-up试剂盒（740.948.250）对总RNA进行过柱纯化；分光光度计定量，琼脂糖凝胶电泳检测其完整性；②总RNA合成cDNA；③体外转录合成cRNA；④cRNA 反转录；⑤荧光标记；⑥芯片杂交；⑦芯片清洗及扫描；⑧用Agilent Feature Extraction（v10.7）软件对杂交图片进行分析并提取数据，用Agilent Gene-Spring软件对数据进行归一化和表达谱差异分析。采用Cluster 3.0软件行Cluster分析和图形化展示。1.3 lncRNA p2819的选择标准FC（abs）表示两组样品的差异倍数；筛选标准为：若FC（abs）在2倍以上，P≤0.05。然后按照差异变化倍数、可靠性P值、有无靶基因、有无文献报道等因素筛选出lncRNA p2819。
1.4 qRT-PCR验证实验选取72例胃癌患者的癌组织及配对正常胃黏膜组织标本，研末，Trizol试剂（美国Invitrogen公司）提取总RNA后进行分光光度计检测。采用反转录引物Oligo（dT）15 Primer试剂（美国Promega）进行反转录，加入10 μl配制好的RT-Mix 反应体，设置反转录程序，完成反转录。加入ABI Power SYBR Green PCR Master Mix（美国ABI公司）进行qRT-PCR反应。以甘油醛-3磷酸脱氢酶（GAPDH）作内参，采用荧光定量聚合酶链反应（polymera chain reaction，PCR）仪（ABI 7900T）及软件SDS
2.4记录并分析。PCR引物由上海生物工程有限公司合成。引物序列：lncRNA p2819上游序列：5'-GGTG AGCAGGAGCCGAGAC-3'，下游序列：5'-TGAAA TGGAGCACGGTAGCC-3'。内参基因GAPDH上游序列：5'-TCAAGAAGGTGGTGAAGCAGG-3'，下游序列：5'-GCGTCAAAGGTGGAGG
AGTG-3'。qRT-PCR实验每个样本重复3次，测得的相对表达量采用2-ΔΔCt方法表示。
1.5 lncRNA p2819表达量与临床参数相关性分析收集患者相关资料，分析lncRNA p2819在胃癌组织中的表达量，并探讨其与患者性别、年龄、肿瘤部位、肿瘤直径、肿瘤TNM分期、肿瘤分化等临床参数的相关性。其中按性别分为男、女两组；按年龄分为高龄组（≥60岁）和低龄组（＜60岁）；按肿瘤部位分为胃窦部和非胃窦部两组；按肿瘤最大直径分为≥5 cm和＜5 cm两组；按TNM分期分为Ⅰ/Ⅱ期和Ⅲ/Ⅳ期两组；按病理分化程度分为低分化组和中/高分化组。
1.6 统计学方法芯片筛查结果的统计采用Gene-Spring GX软件计算基因表达差异。应用t检验计算得到P值，并采用FDR及Benjamini-Hochberg方法校正。采用SPSS 19.0软件进行数据统计分析。对于qRT-PCR实验中lncRNA p2819在癌组织及其配对癌旁组织中相对表达量的比较采用t检验；对于胃癌组织中lncRNA p2819相对表达与临床参数相关
性分析的统计，各组之间的比较应用矫正χ2检验。P＜0.05代表差异有统计学意义。
2 结果
2.1 芯片筛查发现5445个差异表达的lncRNA，其中差异倍数超过2倍、可靠性P＜0.05的有19个上调，56个下调；选取lncRNA p2819作为研究对象，其差异倍数下调超过10倍，邻近的编码蛋白基因
（靶基因）为CP A2。lncRNA p2819基因信息：探针号p2819；基因ID：OTTHUMT00000421557.1；位置：11号染色体，反义RNA。
炸藕片的做法
2.2 qRT-PCR实验lncRNA p2819在胃癌组织中的相对表达量为0.3±0.35，在配对癌旁正常胃组织中的相对表达量为1.51±0.65。t检验结果显示差异具有统计学意义（P＜0.01），说明lncRNA p2819在胃癌组织中的相对表达量显著低于癌旁正常组织，属于相对表达量下调的基因，qRT-PCR验证的
结果与芯片筛查结果一致。
2.3 lncRNA p2819在胃癌组织中的表达及其与临床参数的相关性分析以胃癌组织中p2819相对表达量中位数0.29为界分为非明显下调组（≥0.29，36例）和明显下调组（＜0.29，36例）。p2819相对表达量下调情况与胃癌分化程度、TNM分期呈显著负相关（均P＜0.05），而与性别、年龄、肿瘤部位、肿瘤最大直径等无显著相关性（均P＞0.05）（表1）。
3 讨论
lncRNA是指序列长度＞200 bp的非编码RNA。根据lncRNA在基因组中的位置，以及lncRNA与邻近蛋白编码基因的位置关系可以将其分为5种类型，即正义、反义、双向、基因内及基因间[8]。起初认为lncRNA不编码蛋白，不具有生物学功能。但近期研究表明，lncRNA在染色质、转录及转录后水平等
多个层面调节基因表达，与肿瘤的发生、发展密切相关。随着高通量测序和芯片筛查的广泛应用，关于肿瘤中lncRNA差异表达研究的文献逐渐增多，相关研究发现，不同部位肿瘤中有不同的lncRNA 发挥作用[9]。研究发现，与胃癌相关的lncRNA中，H19、CCAT1、AC130710、MALAT-1、GHET1、HULC等均在胃癌组织中显著高表达；其中lncRNA H19可以促进胃癌细胞的增长，将其敲低或沉默后可诱导胃癌细胞的凋亡，说明lncRNA H19具有类似原癌基因的作用[10]。其他高表达的lncRNA可促进癌细胞的增殖和侵袭，但作用途径各不相同[11-15]。胃癌组织中表达下调的lncRNA也很多，如FER1L4、GAS5、MEG3等。这些表达下调的lncRNA在胃癌组织中的低表达程度与肿瘤大小和分期有关，低表达的患者提示预后不良。这些下调的lncRNA经体外实验过表达后可以抑制胃癌细胞增殖，同时诱导胃癌细胞凋亡[16-18]。这些lncRNA可作为胃癌潜在的诊断标志物和治疗靶点，在胃癌的诊断、治疗及预后监测方面具有潜在应用价值。
胃癌中有大量差异表达的lncRNA。Lin等[19]利用lncRNA芯片对胃癌及癌旁组织进行检测，发现胃癌组织中有2621条差异表达的lncRNA。Song等[20]在胃癌组织中发现了135个差异表达的lncRNA。为了发现更多新的与胃癌相关的lncRNA，本研究通过芯片对5对胃癌组织及其配对癌旁正常胃组织进行筛查，发现了5445个差异表达的lncRNA。由此可见，胃癌组织中差异表达的lncRNA在不同研究中结果并不一致。这可能与标本病理类型、病理分期和应用的lncRNA芯片不同有关。
本研究选取lncRNA p2819作为研究对象，不仅因其具有较高的差异表达倍数，而且文献中相关报道不
多，可能为一个新的胃癌标志物。本研究中，lncRNA p2819在胃癌中低表达，为明确lncRNA 表1 lncRNA p2819在胃癌组织中的表达及其与临床参数的
相关性分析（例）
临床参数
例数
（n＝72）
lncRNA p2819相对表达量
P
明显下调组
（n＝36）
非明显下调组
（n＝36）
年龄0.609≥60岁502624
＜60岁221012
性别0.800男492425
女231211
哄女友睡前浪漫小故事肿瘤位置0.814胃窦371819
非胃窦部351817
肿瘤最大直径0.609≥5 cm221210
＜5 cm502426
疲劳造句肿瘤分化程度0.009*中/高分化20515
低分化523121
肿瘤TNM分期0.033*Ⅰ/Ⅱ期331221
Ⅲ/Ⅳ期392415
2819差异表达的可靠性，本研究扩大样本量行qRT-PCR实验验证，结果显示，其在胃癌组织中的相对表达量较癌旁正常胃黏膜组织显著下调，差异具有统计学意义，且与芯片筛查的结果一致，提示其可以作为潜在的胃癌诊断标志物，用于胃癌的辅助诊断。为明确这种差异表达是否具有临床意义，本研究分析了其相对表达量与临床参数的相关性，发现其与胃癌恶性程度、TNM分期呈显著负相关，即恶性程度越高、分期越晚，lncRNA 2819下调程度越明显；但其与患者的性别、年龄、肿瘤部位、肿瘤最大直径等参数无显著相关性，表明lncRNA p2819的相对表达量显著下调可以提示肿瘤的恶性程度高、分期晚、预后不良。另外，由于lncRNA 在正常胃黏膜组织中相对表达量较高，而在胃癌组织中表达下调，提示其可能具有抑癌基因的作用。对其过表达后，能否抑制肿瘤生长而成为潜在的治疗靶点仍有待试验证实。
综上所述，lncRNA p2819的相对表达量与胃癌恶性程度、TNM分期呈显著负相关，可以将其作为胃癌新的标志物和潜在的治疗靶点。
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收稿日期：2020-07-14
本文编辑：王晨
引用本文：史宏志，达布西力特，高宏凯，等．长链非编码RNA p2819在胃癌组织中的差异表达及其意义[J]．肿瘤综合治疗电子杂志，2021，7（1）：47-50．
