·胃癌专题·ＣＰＮＥ家族在胃癌中的表达水平及其与患者
预后的关系胎动频繁
张晓红 李 凡 贝颂华 李欢庆 李德明 冯 莉
【摘要】 目的 分析ＣＰＮＥ家族在胃癌患者中的表达水平及其与患者预后的关系。
工程部
方法 通过生物信息学网站分析ＣＰＮＥ家族与胃癌患者预后的关系，分析ＣＰＮＥ８的表
达水平与患者临床病理学特征及生存率的关系，探究敲低ＣＰＮＥ８表达后对胃癌细胞增
殖的影响。结果 生物信息学分析结果显示，ＣＰＮＥ１、ＣＰＮＥ２、ＣＰＮＥ３、ＣＰＮＥ７、
ＣＰＮＥ８、ＣＰＮＥ９在胃癌组织中的表达水平显著高于正常胃组织，但ＣＰＮＥ６在胃癌组织
中的表达水平显著低于正常胃组织。低表达的ＣＰＮＥ６和高表达的ＣＰＮＥ８与胃癌患者
较短的总体生存时间密切相关。ＣＰＮＥ８的表达水平与肿瘤分期呈显著正相关。生物信
息学预测显示，ＣＰＮＥ８与细胞黏附、细胞外基质（ＥＣＭ） 受体相互作用、环鸟苷酸
（ｃＧＭＰ）／蛋白激酶Ｇ（ＰＫＧ）信号通路、磷脂酰肌醇３ 激酶（ＰＩ３Ｋ）／蛋白激酶Ｂ（Ａｋｔ）信
号通路和Ｒａｐ１信号通路等有关。敲低ＣＰＮＥ８表达能够显著抑制胃癌细胞增殖。结论
本研究首次揭露了ＣＰＮＥ家族在胃癌中的表达水平与患者预后的关系，提示ＣＰＮＥ家
族可能成为新的胃癌诊断靶点。该研究为阐述ＣＰＮＥ８在胃癌中的潜在作用提供了线
索，指出ＣＰＮＥ８可能作为胃癌患者预后的独立预测因子，提示ＣＰＮＥ８的下调可能为胃
癌患者的治疗提供新的治疗策略。
【关键词】 ＣＰＮＥ；胃癌；生物信息学
ＤＯＩ：１０．３９６９／ｊ．ｉｓｓｎ．１６７３ ５３４Ｘ．２０２０．０６．００５
犈狓狆狉犲狊狊犻狅狀狅犳犆犘犖犈犳犪犿犻犾狔犻狀犵犪狊狋狉犻犮犮犪狀犮犲狉犪狀犱犻狋狊狉犲犾犪狋犻狅狀狊犺犻狆狑犻狋犺狆狉狅犵狀狅狊犻狊狅犳狆犪狋犻犲狀狋狊 犣犎犃犖犌
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【犃犫狊狋狉犪犮狋】 犗犫犼犲犮狋犻狏犲 ＴｈｉｓｐａｐｅｒｉｎｔｅｎｄｓｔｏａｎａｌｙｚｅｔｈｅｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎｏｆＣＰＮＥｆａｍｉｌｙｉｎｇａｓｔｒｉｃ
ｃａｎｃｅｒａｎｄｉｔｓｒｅｌａｔｉｏｎｓｈｉｐｗｉｔｈｔｈｅｐｒｏｇｎｏｓｉｓｏｆｇａｓｔｒｉｃｃａｎｃｅｒ．犕犲狋犺狅犱狊 Ｔｈｅｒｅｌａｔｉｏｎｓｈｉｐｂｅｔｗｅｅｎｔｈｅ
ＣＰＮＥｆａｍｉｌｙａｎｄｔｈｅｐｒｏｇｎｏｓｉｓｏｆｇａｓｔｒｉｃｃａｎｃｅｒｗａｓａｎａｌｙｚｅｄｏｎｔｈｅｂｉｏｉｎｆｏｒｍａｔｉｃｓｗｅｂｓｉｔｅ．Ｔｈｅ
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ＣＰＮＥ１，ＣＰＮＥ２，ＣＰＮＥ３，ＣＰＮＥ７，ＣＰＮＥ８，ａｎｄＣＰＮＥ９ｉｎｇａｓｔｒｉｃｃａｎｃｅｒｗａｓｓｉｇｎｉｆｉｃａｎｔｌｙｈｉｇｈｅｒｔｈａｎ
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语言活动ｉｎｈｉｂｉｔｅｔｈｅｐｒｏｌｉｆｅｒａｔｉｏｎｒａｔｅｏｆｔｕｍｏｒｃｅｌｌｓ．犆狅狀犮犾狌狊犻狅狀狊 Ｔｈｉｓｐａｐｅｒｒｅｖｅａｌｅｄ，ｆｏｒｔｈｅｆｉｒｓｔｔｉｍｅ，ｔｈｅ
作者单位：２０１１９９ 上海，复旦大学附属闵行医院内镜中心
ｒｅｌａｔｉｏｎｓｈｉｐｂｅｔｗｅｅｎｔｈｅｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎｏｆＣＰＮＥｆａｍｉｌｙｉｎｇａｓｔｒｉｃｃａｎｃｅｒａｎｄｐａｔｉｅｎｔｐｒｏｇｎｏｓｉｓ，ｓｕｇｇｅｓｔｉｎｇｔｈａｔｔｈｅＣＰＮＥｆａｍｉｌｙｍａｙｂｅｃｏｍｅａｎｅｗｄｉａｇｎｏｓｔｉｃｔａｒｇｅｔｆｏｒｇａｓｔｒｉｃｃａｎｃｅｒ．Ｔｈｉｓｐａｐｅｒｐｒｏｖｉｄｅｓｃｌｕｅｓｔｏ
ｅｌｕｃｉｄａｔｅｔｈｅｐｏｔｅｎｔｉａｌｒｏｌｅｏｆＣＰＮＥ８ｉｎｇａｓｔｒｉｃｃａｎｃｅｒ．ＣＰＮＥ８ｍａｙｓｅｒｖｅａｓａｎｉｎｄｅｐｅｎｄｅｎｔｐｒｏｇｎｏｓｔｉｃｆａｃｔｏｒｆｏｒｇａｓｔｒｉｃｃａｎｃｅｒｐａｔｉｅｎｔｓ，ｓｕｇｇｅｓｔｉｎｇｔｈａｔｔｈｅｄｏｗｎ ｒｅｇｕｌａｔｉｏｎｏｆＣＰＮＥ８ｍａｙｐｒｏｖｉｄｅａｎｅｗｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃｓｔｒａｔｅｇｙｆｏｒｔｈｅｔｒｅａｔｍｅｎｔｏｆｇａｓｔｒｉｃｃａｎｃｅｒｐａｔｉｅｎｔｓ．
【犓犲狔狑狅狉犱狊】 ＣＰＮＥ；Ｇａｓｔｒｉｃｃａｎｃｅｒ；Ｂｉｏｉｎｆｏｒｍａｔｉｃｓ
胃癌是世界范围内病死率较高的恶性肿瘤，也是目前东亚地区较常见的胃肠道恶性肿瘤［１ ４］。许多患者在初诊时即被诊断为进展期胃癌，错过了最佳手术期，而晚期胃癌患者的预后较差［５ ６］。因此，亟需开展更多的研究来探寻应用于胃癌诊断和治疗的有效生物学标志物和靶标。大多数肿瘤患者的死亡与肿瘤转移及浸润有关。患者经胃切除术后，局部区域的肿瘤复发风险仍较高［７ ８］。基于酪氨酸激酶抑制剂（ＴＫＩ）的特定分子靶向药物的应用可使转移性胃癌患者受益［９ １０］。但由于肿瘤细胞的固有抗性或获得性抗性，胃癌患者仍会产生ＴＫＩ抗性并导致不良的临床进展［１１］。探索有效的预后分子生物学标志物及其在肿瘤进展、转移中的分子机制，对于评估和管理胃癌患者至关重要。
ＣＰＮＥ８是ＣＰＮＥ家族蛋白的成员之一，该家族蛋白是Ｃａ２＋依赖性磷脂结合蛋白，被认为与跨膜运输有关［１２ １３］。已有报道指出，ＣＰＮＥ家族在肿瘤中发挥着重要的调控作用［１４ １６］。Ｊｉａｎｇ等［１７］报道，沉默ＣＰＮＥ１可抑制人骨肉瘤细胞的增殖、侵袭和迁移。Ｌｉｕ等［１８］报道，ＣＰＮＥ１能够促进肺腺癌细胞的增殖和侵袭。ＣＰＮＥ３可通过激活黏着斑激酶（ＦＡＫ）信号通路与活化的蛋白激酶受体１（ＲＡＣＫ１）相互作用，促进非小细胞肺癌的迁移和侵袭［１９］。ＣＰＮＥ５的表达水平可预测食管鳞状细胞癌根治性切除术后患者的预后情况［２０］。ＰｒＰ是主要位于细胞膜上的糖基磷脂酰肌醇锚定蛋白，在其合成过程中，通过内质网和高尔基体转运至细胞膜，并与脂质筏相连。有研究认为ＰｒＰ可通过网格蛋白介导的内吞作用不断地从细胞膜中回收［２１］。家族性ＰｒＰ的致病性突变通常会导致异常的细胞定位［２２ ２３］。ＣＰＮＥ８在调控ＰｒＰ的正常运输中发挥着至关重要的作用。ＰｒＰ的异常往往与肿瘤的发生具有密切联系。目前ＣＰＮＥ８在胃癌中的作用尚不明确。本研究分析了肿瘤基因组图谱（ＴＣＧＡ）数据库中具有临床病理学特征和患者生存率数据的ＣＰＮＥ的表达，使用基因集富集分析（ＧＳＥＡ）探究了ＣＰＮＥ可能参与胃癌进展的生物学机制。
１ 材料和方法
１．１ 公共数据分析
基因表达谱交互分析（ＧＥＰＩＡ）数据库共有４０８例胃癌患者的基因表达数据以及３６个正常胃组织样本的数据。基于该数据库中所有样本的临床信息，分析ＣＰＮＥ家族的表达水平与患者生存率的关系，以总生存时间为衡量指标。
１．２ ＲＮＡ检测
使用ＴＲＩｚｏｌ（美国Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ公司）试剂提取组织ＲＮＡ，严格按照试剂盒使用说明书操作。使用ＮａｎｏＤｒｏｐ２０００分光光度计（美国ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒＳｃｉｅｎｔｉｆｉｃ公司）检测ＲＮＡ的纯度和摩尔浓度。按照制造商的说明进行定量聚合酶链反应（ｑＰＣＲ）分析。ＣＰＮＥ８的相对表达量以２－△△Ｃｔ表示（ΔＣｔ＝ＣｔＣＰＮＥ８－ＣｔＧＡＰＤＨ），引物购自苏州金唯智生物科技有限公司，引物序列见表１。我的大学主要内容
表１ 引物序列
基因序列
ＧＡＰＤＨ
正向：５′ ＣＡＴＧＴＴＣＧＴＣＡＴＧＧＧＴＧＴＧＡＡＣＣＡ ３′
反向：５′ ＡＧＴＧＡＴＧＧＣＡＴＧＧＡＣＴＧＴＧＧＴＣＡＴ ３′
ＣＰＮＥ８
正向：５′ ＣＡＡＴＧＧＴＣＧＡＡＴＴＧＧＡＴＧＧＡＧＡ ３′
反向：５′ ＧＣＣＡＴＧＣＴＣＡＧＴＡＴＧＴＧＧＴＴＴＣ ３′１．３ 细胞培养和瞬时转染
ＡＧＳ细胞和Ｎ８７细胞均购自美国ＡＴＣＣ公司。在含有１０％ＦＢＳ（购自美国Ｇｉｂｃｏ公司）和预防性支原体ＰｌａｓｍｏｃｉｎＴＭ预防剂（ａｎｔ ｍｐｐ）的高葡萄糖ＤＭＥＭ培养基（购自武汉普诺赛生命科技有
限公司）中培养肿瘤细胞。在３７℃下，５％ＣＯ
２
培养箱中培养。
１．４ 细胞增殖试验
使用ｓｉ ＣＰＮＥ１或ｓｉＲＮＡ（购自上海吉玛制药技术有限公司）阴性对照（ＮＣ）转染Ａ４９８和Ｃａｋｉ １细胞，然后将细胞以３０００个／孔的密度添加至９６孔板中。使用细胞计数试剂盒８（日本同仁化学ＣＣＫ ８试剂盒）检测细胞增殖率（ＯＤ值）。
１．５ 生物信息学分析
使用ＤＡＶＩＤ生物信息数据库分析ＣＰＮＥ８参与胃癌发病机制的调控途径［２０］。
１．６ 统计学分析
所有数据均采用ＳＰＳＳＳｔａｔｉｓｔｉｃｓ２２．０软件进行统计学分析。Ｋａｐｌａｎ Ｍｅｉｅｒ（ＫＭ）曲线通过对数秩检验评估了患者的临床生存率和ＣＰＮＥ８的表达水平。采用单因素和多因素Ｃｏｘ比例风险回归方法分析胃癌中ＣＰＮＥ８的表达水平对于患者预后的意义［２１］。犘＜０．０５为差异有统计学意义。２ 结果
２．１ ＣＰＮＥ家族在胃癌中的表达
本研究分析了ＴＣＧＡ数据库中９个ＣＰＮＥ家族成员（ＣＰＮＥ１～９）的信使ＲＮＡ（ｍＲＮＡ）表达水平。由图１可知，ＣＰＮＥ１、ＣＰＮＥ２、ＣＰＮＥ３、ＣＰＮＥ７、ＣＰＮＥ８、ＣＰＮＥ９在胃癌组织中的表达水平显著高于正常胃组织，但ＣＰＮＥ６在胃癌组织中的表达水平显著低于正常胃组织。同时观察到，ＣＰＮＥ４和ＣＰＮＥ５在胃癌组织和正常胃组织中的表达水平差异无统计学意义。
注： 犘＜０．００１
图１ ＣＰＮＥ家族在胃癌组织和正常胃组织中的表达
２．２ ＣＰＮＥ家族的表达水平对于胃癌预后的意义根据９个ＣＰＮＥ家庭成员的中位表达水平，将所有患者分为两组（高表达组和低表达组）。单因素分析显示，ＣＰＮＥ６和ＣＰＮＥ８的表达与患者的生存时间相关。ＫＭ曲线分析结果表明，ＣＰＮＥ８高表达患者的总生存时间比低表达者更短。此外，虽然ＣＰＮＥ６在胃癌中呈低表达，但是ＣＰＮＥ６高表达患者的总生存时间比低表达者更短。此外，研究显示ＣＰＮＥ１、ＣＰＮＥ２、ＣＰＮＥ３、ＣＰＮＥ４、ＣＰＮＥ５、ＣＰＮＥ７、ＣＰＮＥ９在胃癌中的表达水平与患者的总生存时间无显著关联。以上结果提示相较于其他家族成员，ＣＰＮＥ６和ＣＰＮＥ８在胃癌中发挥着更重要的作用。见图２。２．３ ＣＰＮＥ８与患者临床病理学特征的关联
由图３Ａ可知，ＣＰＮＥ８高表达与肿瘤分期呈显著正相关。ＣＰＮＥ８在高分期胃癌中的表达水平显著高于低分期的胃癌样本。人种分析显示，ＣＰＮＥ８在非裔美国人中的表达水平显著高于白种人和亚洲人（见图３Ｂ）。ＣＰＮＥ８表达与淋巴结转移（Ｎ期）的关联分析显示，ＣＰＮＥ８在Ｎ１、Ｎ２、Ｎ３期胃癌中的表达水平显著高于Ｎ０期胃癌，其在Ｎ２期胃癌中的表达水平最高（见图３Ｃ）。ＣＰＮＥ８表达与年龄的关联分析显示，ＣＰＮＥ８在４０岁以上胃癌患者肿瘤组织中的表达水平显著高于２１～４０岁者，其在４１～６０岁胃癌患者肿瘤组织中的表达水平最高（见图３Ｄ）。ＣＰＮＥ８表达与肿瘤分化程度的关联分析显
示，ＣＰＮＥ８在低分化胃癌患者肿瘤组织中的表达水平显著高于中、高分化胃癌患者（见图３Ｆ）。而ＣＰＮＥ８的表达水平与患者的性别（见图３Ｅ）及幽门螺杆菌感染情况（见图３Ｇ）无相关性。
拐卖妇女图２ ＣＰＮＥ家族在胃癌组织中的表达水平与患者总生存时间的关联 犃 ＣＰＮＥ１ 犅 ＣＰＮＥ２ 犆 ＣＰＮＥ３ 犇 ＣＰＮＥ４ 犈 ＣＰＮＥ５ 犉 ＣＰＮＥ６ 犌 ＣＰＮＥ７ 犎 ＣＰＮＥ８ 犐 ＣＰＮＥ９
２．４ ＣＰＮＥ８在胃癌发病机制中的作用
学生会竞选自我介绍本研究采用生物信息学手段探究ＣＰＮＥ８在胃癌发病机制中的作用。使用ｃＢｉｏＰｏｒｔａｌ数据库获取ＣＰＮＥ８在胃癌中的共表达基因。结果表明，ＣＰＮＥ８可参与细胞黏附等细胞生物学过程，以及心血管系统发育、神经系统发育等过程（见图４Ａ）。京都基因和基因组百科全书（ＫＥＧＧ）富集分析显示，ＣＰＮＥ８在胃癌中参与调控的信号通路包括心肌细胞的肾上腺素信号转导、心律失常性右室心肌病（ＡＲＶＣ）、环鸟苷酸（ｃＧＭＰ）／蛋白激酶Ｇ（ＰＫＧ）信号通路、扩张型心肌病（ＤＣＭ）、细胞外基质（ＥＣＭ） 受体相互作用、黏着斑、肥厚型心肌病（ＨＣＭ）、磷脂酰肌醇３ 激酶（ＰＩ３Ｋ）／蛋白激酶Ｂ（Ａｋｔ）信号通路、Ｒａｐ１信号通路、血管平滑肌收缩等（见图４Ｂ）。２．５ ＣＰＮＥ８表达下调抑制体外胃癌的恶性程度使用ｓｉＲＮＡ敲低ＣＰ
ＮＥ８在胃癌细胞（ＡＧＳ和Ｎ８７）中的表达水平，使用ＣＣＫ ８探究敲低ＣＰＮＥ８表达对于胃癌细胞增殖的影响。结果显示，敲低ＣＰＮＥ８表达能够显著抑制胃癌细胞增殖（见图５）。
图３ ＣＰＮＥ８与胃癌患者临床病理学特征的关联 犃 疾病分期 犅 人种 犆 淋巴结转移分期 犇 年龄 犈 性别 犉 疾病等级 犌 幽门螺旋杆菌感染状况
图４ 生物信息学预测ＣＰＮＥ８在胃癌中的功能与作用 犃 ＣＰＮＥ８在胃癌中参与调控的生物学进程 犅 ＣＰＮＥ８在胃癌中参与调控的信号通路
