Th1细胞亚群和Th1记忆细胞在体内的功能和组织分布①
吴长有② 杨滨燕 朱兆玲 (中山大学基础医学院免疫学教研室，广州510089)
中国图书分类号 R392 文献标识码 A 文章编号 10002484X(2004)0820525206
[摘 要] 目的：检测抗原特异性Th1细胞亚群和记忆性Th1细胞在体内的功能和分布。方法：抗原特异性Th1细胞在体外分化的不同时期，在单个细胞水平上同时检测细胞因子I L22、IFN2γ和I L24的表达和细胞膜表面分子表达。将标记的初始C D4+T细胞和Th1细胞被动输给小鼠后，观察Th1记忆细胞在体内组织器官的分布和IFN2γ的产生。结果：根据细胞因子产生的不同，可将Th1细胞分为不同的亚群。随着Th1细胞分化次数的增加,IFN2γ产生细胞的百分率也随之增加，但I L22阳性细胞的百分率下降。C D62L随着Th1细胞分化次数的增加而减少。当细胞被动输给小鼠2周后，初始C D4+T细胞几乎等数量地分布于淋巴结、脾和肺组织，随着Th1细胞分化次数的增加，效应Π记忆T细胞优先地分布于非淋巴器官肺组织。当再次受到抗原刺激后，迅速产生IFN2γ。结论:Th1细胞是一群非均一细胞，效应Π记忆性Th1细胞在细胞膜分子标记、组织器官的分布和功能等方面均与初始C D4+T细胞不同。
[关键词] C D4+T细胞;Th1亚群；记忆T细胞；细胞因子
Th1cell subt、memory、function and tissue distribution
WU Chang2You,Y ANG Bin2Yan,ZHU Zhao2Ling.Department o f Immunology,School o f Basic Medicine,Zhongshan Univer sity,Guangzhou510080,China
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[Abstract] Objective:Understanding of subt、mem ory cell generation、effector function and organ distribution of Th1cells in vitro and in viv o.Methods:Different stages of polarized Th1cells are generated from antigen2specific C D4+T cells.The expression of cell surface mark2 ers and intracellular cytokines(I L22、IFN2γand I L24)is determined at a single cell level by FACS.Equal numbers of CFSF2labeled naive C D4+T cells and different stages of Th1cells are adoptively trans ferred into m ou.The production of IFN2γand distribution of Th1mem ory cells in lymphoid and non2lymphoid organs are measured.R esults:Th1cell populations can be subdivided into veral subts bad upon the production of I L22and IFN2γ.The percentage of IFN2γ2producing cells is incread and I L222producing cells is decread following repeatedly stimulation under Th1culture condition.M oreover,the expression of C D62L on Th1cells is reduced after activation and differentiation of C D4+ T cells.2weeks post2trans fer,the frequency of naive C D4+T cells is comparable from lymph nodes、spleens and lungs,whereas mem ory Th1 cells are preferentially detected in spleens and lungs and rapidly produce IFN2γfollowing re2exposure to the same antigen.Conclusion:Th1cell population is compod of distinct subts of cells.In compars on with na
ive C D4+T cells,mem ory Th1cells reveal the changes of surface m ole2 cule expression、biologic function and distribution in tissues.
[K ey w ords] C D4+T cell;Th1subt;Mem ory;Cytokine;Surface markers
C D4+T细胞在免疫调节、免疫防御和免疫病理等方面均起着十分重要的作用。当受到抗原的刺激后,C D4+T细胞开始活化、增殖并分化成效应细胞。随着抗原的清除，大量的效应T细胞凋亡，只有少数细胞分化为记忆性T细胞。与初始C D4+T细胞相比，记忆性细胞在数量上、细胞膜表面分子的表达、细胞因子的产生和功能等方面均发生了显著变化1。根据细胞因子产生的不同和生物学功能的不同，可将C D4+T细胞主要分为Th1和Th2两大类,
①本研究为国家自然科学基金资助项目(批准号:30340012;303400
37)；广东省科技计划和广东省教育厅科技攻关项目
②通讯作者
作者简介：吴长有(1955年-)，男，教授，主任，博士生导师，主要从事T细胞分化和免疫记忆方面的研究。Th1细胞产生IFN2γ、T NF2β和I L22，参与细胞介导的免疫反应；而Th2细胞产生I L24、I L25、I L210和I L2 13，参与体液介导的免疫反应2,3。Th1细胞通过产生的IFN2γ激活巨噬细胞，杀伤
多种细胞内寄生的病原微生物。此外,Th1细胞也参与肿瘤免疫和某些自身免疫性疾病的病理反应。目前，有关诱导Th1免疫应答的细胞和分子调节机制有了进一步的了解，正向和负向调节Th1细胞的分化和基因调节因子已被确定，但是否Th1细胞存在着异质性和Th1记忆性T细胞在体内的分布等方面的研究，国内外报道甚少。为此，本研究比较观察了小鼠抗原特异性初始C D4+T细胞和不同程度分化的Th1细胞其细胞因子的产生、表现型和在体内的分布。该结果对于阐述免疫的调节、疫苗的设计、免疫病理机
制和治疗等具有重要的理论和指导意义。
1 材料与方法
111 材料
11111 实验小鼠 OVA2抗原受体转基因小鼠(DO11、10,TCR2T g)购自T aconic(U.S.A)，均为雌性, 6～8周龄4。
11112 主要试剂和仪器 Per2CP标记的抗C D4 (PerCP2C D4)、APC标记抗IFN2γ(APC2IFN2γ)、PE2或APC2抗I L22、PE2抗I L24、APC2抗C D25、APC2抗C D62L、APC2抗C D69和标记的匹配对照抗体均购自美国BDΠPharMingen(Becton2Dickins onΠPharmingen)公司。PE标记K J1226单克
隆抗体特异性认别转基因OVA2抗原受体表达的细胞，购自Caltag Laboratories(Burl ingame,C A)。白细胞介素(I L)212购自BDΠPharmingen。112 方法4
11211 单个细胞，抗原提呈细胞的制备和C D4+T 细胞的分离 简言之，取小鼠脾和淋巴结，研磨、纱网过滤，然后经Ficoll密度梯度离心(2000rΠmin,20分钟)，收取单个核淋巴细胞。抗原提呈细胞(APC)的制备：取正常同系BA LBΠC小鼠脾细胞与抗小鼠C D4+、C D8+T细胞和抗Thy1抗体和补体孵育，去除T细胞，洗涤2次(1800rΠmin,10分钟)后，细胞悬浮于RPMI1640(含10%胎牛血清)培养液中，经γ射线照射(3000rad)后，洗涤细胞2次，吸弃上清，重悬浮于RPMI1640培养液中，计数细胞，作为抗原提呈细胞。C D4+T细胞的分离：取OVA T细胞受体转基因小鼠的单个细胞悬液(TCR2T g)，用P BS+BS A+ E DT A缓冲液洗涤2次(1800rΠmin,10分钟)，按Miltenyi公司说明书叙述的方法加入抗C D4+T细胞磁珠，分离C D4+T细胞。经由抗TCR2T g特异性抗体(K J1226)染色，流式细胞仪分析证明>99%的C D4+T细胞TCR2T g阳性。
11212 Th1细胞的培养4 TCR2T g C D4+T细胞与抗原提呈细胞(1∶6)在OVA抗原多肽(OVA3232339) (1μgΠml)和I L212(2ngΠml)存在的条件下，培养3～4天，洗涤后再加入少量I L22(10UΠml)培养2～3天，称为Th1week1(—周)细胞。如上所述，如此培养3个周期后的细胞称为Th1(week3)细胞。对于细胞内细胞因子的产生，初始C D4+细胞、Th1week1和Th1week3细胞，与抗原提呈细胞1∶6混合，加入OVA多肽(1μgΠml)刺激5小时，刺激的第一个小时后，加入Brefeld2A(BFA)
(购自Sigma)10μgΠml以阻止胞内高尔基体介导的细胞因子转运。
11213 CFSE标记细胞4 初始C D4+2T CR2T g细胞、
Th1week1和Th1week3细胞悬浮于磷酸缓冲溶液中，细胞浓度为10×106细胞Πml。CFSE(购自M olecu2 lar Probes公司,Eugene,OR)加入细胞悬液中，其终浓度为0125μm olΠL，细胞与CFSE于室温孵育7分钟，然后用P BS洗涤3次，并悬浮于RP MI1640培养液中。11214 体内被动细胞的输入和细胞制备4 CFSE2标记的同等数量的初始C D4+2T CR2T g细胞、Th1week 1细胞和Th1week3细胞静脉输给相同遗传背景的BA LBΠC小鼠，每只小鼠输入5×106个细胞，每组3只小鼠，在细胞输入的14天后，处死小鼠，取淋巴结(lym ph n odes)、脾脏(spleens)和肺组织(lungs)，并将来自同组的相同的组织细胞混合，溶解红细胞，然后制备单个细胞悬液，洗涤2次后，细胞悬浮于RP MI1640完全培养液中。课程教案
11215 被动输入体内细胞及其功能的检测4 取自从各组织器官制备的细胞悬液(2×106ml-1)，加入OV A抗原多肽(1μgΠml),37℃孵育1小时后，加入BFA10μgΠml以阻止胞内高尔基体介导的细胞因子转运。孵育5小时后，收集细胞、固定、破膜、经标记的抗体染色后，利用流式细胞仪检测其组织中被动输入细胞的百分率与细胞因子的产生。
11216 细胞染色 细胞表面染色按照常规染色方法进行，简言之，细胞悬液100μl加入标记的抗细胞
表面特异性抗原的抗体,4℃下避光反应30分钟，洗涤2次(1800rΠmin,8分钟)。细胞内细胞因子的染色5：将待测细胞用P BS洗涤2次后，加入细胞固定液，室温固定7分钟，洗涤2次，然后加入200μl含有通透剂(Saponin,Sigma)的牛乳缓冲液作用过夜，加入特异性的胞内标记单抗,4℃避光反应30分钟，洗涤2次,300μl染色缓冲液重悬细胞，流式细胞仪分析实验结果。
11217 流式细胞仪分析 应用流式细胞仪FACS Calibur进行检测。首先以C D4和CFSE双阳性细胞群开窗，再以TCR2T g抗原表面标志(K J1226)和CFSE 双标记细胞群开窗，最后检测K J1226细胞群中IFN2γ的阳性率。Cell quest收集细胞(总数50000个细胞)，并分析流式结果。
2 结果
211 Th1细胞亚群 OV A抗原特异性初始C D4+T细胞在抗原提呈细胞存在的情况下，经抗原(OV A)多肽和I L212刺激3～4天，洗涤后，悬浮于含有低浓度I L2 2(10UΠml)的培养液，继续培养3～4天后(静止细胞)，在抗原提呈细胞存在的情况下，再利用相同抗原多肽刺激细胞,5小时后，如在方法中所述，利用抗I L2
2、抗I L 24和抗IFN 2
γ抗体同时进行细胞内染色，在单个细胞水平上检测初始C D4+
T 细胞和分化不同次数
Th1细胞细胞因子的表达4
满江红诗歌。从图1可以看出，根据细胞因子表达的不同，可将Th1细胞分为不同的亚
群，即IFN 2γ、I L 22和I L 24单阳性,IFN 2γ和I L 22、IFN 2γ和I L 24、I L 22和I L 24双阳性细胞亚群。当抗原特异性初始C D4+
T 细胞受到抗原刺激后,37%左右的细胞
产生I L 22、7%左右的细胞I L 22和IFN 2
γ双阳性。与文献报道的相一致,I L 212诱导并促进Th1细胞的分
化和IFN 2
γ的产生6,7。随着刺激次数的增加,IFN 2γ单阳性细胞明显增加,Th1week 1细胞IFN 2
γ的阳性率是2619%，而Th1week 38716%,I L 22阳性细胞明显下降,Th1week 1细胞为8914%，而Th1week 3细胞是5611%。I L 24的产生无明显变化。212 Th1细胞表现型分析 Th1week 1细胞和w
eek 3细胞与低剂量I L 22孵育静止3天后，进行细胞膜
表面C D25、C D69和C D62L 的检测。结果表明，静止后的Th1week 1和week 3与静止前相比，细胞的大
小明显缩小和C D25的表达明显减少8
冰箱结冰怎么办。与初始
C D4+
T 细胞相比,Th1week 1和week 3细胞仍表达
低水平C D25分子,C D69表达没有差异，有趣的是,
随着刺激次数的增加C D62L 的表达逐渐减少，与初
始C D4+
T 细胞相比,Th1week 1细胞C D62L 表达减少50%，而Th1week 3细胞减少90%以上(图2)。213 效应Π记忆Th1细胞在体内的分布
4
用CFSE 标记初始C D4+
T 细胞和Th1细胞后被动静脉输入给小鼠,14天后处死小鼠，从淋巴结、脾和肺组织分离单个细胞，用抗C D4抗体和K J1226抗体染色细胞，细胞
设门(gating )包括所有的C D4+
T 细胞，然后观察K J1226和CFSE 双阳性细胞。结果表明，初始T 细胞几乎
等数量地分布于淋巴结、脾和肺组织中。有趣的是，随着细胞的分化,Th1细胞主要分布于肺组织。与淋
巴结内相比，初始K J1226+C D4+
T 细胞在肺组织中的
分布是淋巴结内K J1226+
细胞的2倍,Th1week 1细胞是18倍，而Th1week 3细胞是200倍以上，几乎所有的Th1细胞均分布于肺
部和脾脏。此外，从CFSE 减少的结果中可以看出,Th1细胞在肺部和脾脏中仍然保持着低速度的分裂(2～3次)
。
图1 初始CD4+T 细胞和Th1细胞亚群
Fig 11 N aive CD4+
T cells and subts of Th1cells
N ote :11TCR 2T g CD4+T cells were is olated from spleens of DO11110mice and stimulated with OVA or OVA ±I L 212in the prence of antigen 2prenting cells for
3days ,rested with low do of I L 22for another 223days and re 2stimulated in the same antigen for 5hrs.The cells were then fixed and cellular cytokines as 2sayed by FACS.21The numbers in each corner of graft reprent the percentage of cells.
图2 CD25,CD69和CD62L在初始CD4+T细胞和Th1细胞表面的表达
Fig12 Expression of CD25,CD69and CD62L on naive CD4+T and Th1cells
N ote:Cell culture conditions were performed as described as in Fig11.
图3 初始CD4+T细胞和Th1细胞在淋巴组织和非淋巴组织的分布
Fig13 Distribution of naive CD4+T cells and Th1cells in lymphoid and non2lymphoid tissues
N ote:Cell cultures in vitro were carried out as described in Fig11.A fter rested for3days,the cells were labelled with CFSC and trans ferred into BA LBΠC mice.
10days after trans fer,cells were prepared from lym ph nodes,spleens and lungs,and stained with anti2CD4and K J1226.The cells were first gated on CD4+
T cells and then examined K J1226and CFSE double positive cells.
图4 初始CD4+T细胞和记忆性Th1细胞γ2干扰素的产生
Fig14 Production of IFN2γfrom naive CD4+T cells and Th1cells以儆效尤
N ote:Cell cultures in vitro and trans fer in viv o were done as described as in Fig13.10days after trans fer,cells were prepared from lym ph nodes,spleens and lungs, and stimulated in vitro with OVA for5hours.The cells were fixed and stained with anti2CD4,K J1226and anti2IFN2γ.
214 记忆性Th1细胞在体外IFN2γ的表达 为了深入研究记忆性Th1细胞的功能,CFSE标记的初始C D4+T和Th1细胞分别静脉输给小鼠,14天后，从淋巴结、脾和肺脏分离单个细胞，加入OVA多肽抗原刺激细胞，同时加入BFA阻止细胞因子释放,5小时后，收集细胞、固定、破膜，进行四色染色。细胞设门于C D4+T细胞、K J1226+和CFSE双阳性细胞。然后观察K J1226+细胞的IFN2γ+细胞。从图4可以看出，初始C D4+TCR2T g细胞产生IFN2γ的百分率很低(0～1%),Th1week1细胞表达IFN2γ的百分率在脾脏(811%)和肺中(1013%)明显高于淋巴结中(2107%)。在脾和肺中，大约有20%～30%的Th1 week3细胞表达IFN2γ。3 讨论
本研究利用抗原特异性C D4+T细胞，体外在抗原刺激和在促进Th1细胞培养条件下(OVA+I L22)，利用多种抗细胞因子抗体在单个细胞水平上进行比较研究，发现Th1细胞并非均一的细胞群体，根据IFN2γ和I L22的产生，可将Th1细胞至少分为I L2 2+、I L22+IFN2γ+和IFN2γ+三个亚群。随着抗原刺激次数的增加,I L22+IFN2γ+双阳性细胞和IFN2γ+单阳性也随之增加，而I L22+单阳性细胞逐渐减少。
I L22产生的缺乏可能与长期培养的Th1细胞容易发生自发性凋亡有关8。值得提出的是，我们以前的研究已经提示IFN2γ+细胞和IFN2γ2细胞均属于Th1
细胞，两者均表达几乎同等量的T2bet和I L212Rβ24。此外，在体内IFN2γ细胞可转变为长期记忆性T细胞4。目前，这些不同亚群Th1细胞在体内外是否具有不同的生物学，还需要进一步探讨。
效应和记忆C D4+T细胞不论是在形态学上还是在生物学功能方面均不同于初始C D4+T细胞。当细胞被激活之后，其中细胞膜表面的粘附分子C D62L随着激活次数的增加，其表达逐渐减少1。目前认为C D62L和某些其它细胞表面分子与细胞的迁移有着密切的关系9。本研究表明，当标记的初始C D4+T细胞、效应Π记忆Th1细胞被动地转移给正常的小鼠后，效应Π记忆Th1细胞优先地分布于脾脏和非淋巴样器官即肺组织。初始C D4+T细胞几乎等同地分布于淋巴结、脾脏和肺部。从此结果中可以看出，上述现象与免疫应答有着密切的关系。通常情况下，抗原或病原微生物进入机体的部位主要是非淋巴器官，当专职性抗原提呈细胞(DC)摄取、降解抗原，并迁移到附近的淋巴结，将抗原提呈给抗原特异性的初始C D4+T细胞，当C D4+T细胞在淋巴组织活化、增殖分化成效应细胞后，细胞表面的粘附分子和趋化因子受体的表达发生了改变，使效应C D4+T细胞迁移出淋巴结，游走并停留于抗原或病原微生物入侵的部位，发挥免疫功能9,10。当抗原或病原微生物被清除后，大多数效应C D4+T细胞死亡，只有极少数效应C D4+T细胞转变为记忆T 细胞11，这些记忆T细胞可以在体内存活很长时间，主要分布于非淋巴器官，保持着低速分裂，维持着记忆T细胞达到一定水平8,10。近年来的研究提示，根据C D62L和CCR7分子表达的不同还可以将记忆T细胞分为两大群，一群是C D62L hi和CCR7+细胞，称为中央型记忆T细胞，主要分布于淋巴组织；而另外一群细胞是C D62L lo和CCR72，称为效应型记忆T
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细胞，主要分布于非淋巴组织。当受抗原刺激后，中央型记忆T细胞可转变为效应型记忆T细胞，发挥免疫应答功能12。我们的实验结果显示,Th1 week3细胞主要分布于非淋巴组织和脾脏。当经相同抗原再一次刺激后，可迅速转变为效应细胞，释放IFN2γ。Th1week3细胞是效应型T细胞或中央型T 细胞，尚有待进一步研究。
本研究的意义在于深入了解Th1细胞的多样性、生物活性以及在组织器官中的分布，对于疫苗的设计，肿瘤和自身免疫性疾病的治疗具有指导意义。
致谢：在本课题完成期间得到美国国立卫生院(NIH)Dr.R obert A Seder的大力支持，特此表示感谢。
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[收稿2004204229
不白之冤
(编辑 许四平)
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