中国细胞生物学学报 Chine Journal of Cell Biology 2020, 42(12): 2282-2288DOI: 10.11844/cjcb.2020.12.0020
单细胞测序技术在脂肪组织研究中的应用
胡帆杨颖*
*收稿 口期:2020-07-15
接受日期:2020-09-15
国家自然科学基金(批准号:81670778、81974122)资助的课题
*通讯作者。Tel: ************, E-mail: *******************
Received: July 15,2020
Accepted: September 15,2020
This work was supported by the National Natural Science Foundation of China (Grant No.81670778, 819M122)
♦Correspinding author. Tel: +86-21-64749885, E-mail: ******************* URL: www.cjcb/arts.asp?id=5418
(上海交通大学附属第六人民医院，上海市糖尿病研究所，上海200030)
摘要 脂肪组织由多种不同类型和功能各异的细胞构成，呈现出复杂的异质性，单细胞测序
技术为揭示脂肪组织的异质性提供了重要手段。该文对单细胞测序技术在脂肪组织中的应用进行 总结，从该技术在脂肪细胞异质性，免疫细胞与脂肪细胞的交互调控作用和脂肪细胞分化的拟时序
分析等方面进行探讨，旨在全面、充分认识该技术在脂肪组织研究中的重要作用和意义，从而更好
地将其用于脂肪组织和代谢性疾病等方面的研究。
关键词
志莲净苑单细胞测序；脂肪组织；异质性
安徒生童话有哪些童话Application of Single Cell Sequencing Technology in Adipo Tissue
HU Fan, YANG Ying *
(Shanghai Diabetes Institute, Shanghai Jiao Tong University Affiliated Sixth People s Hospital, Shanghai 200030, China)
Abstract Adipo tissue is compod of different types and functions of cells, showing complex hetero
geneity. Single cell transcriptome quencing technology provides an important tool for deconvolving cellular
heterogeneity. The current review summarizes the application of single cell quencing in adipo tissue, including
adipocyte heterogeneity, the crosstalk between immune cells and adipocytes, and the pudotime analysis of adipo
cyte differentiation, aiming to address the important role and significance of this technology in the study of adipo
tissue and apply it to metabolic dias.
Keywords single cell quencing; adipo tissue; heterogeneiry
qq空间相册
对于脂肪组织和细胞的异质性研究，有助于我 们更深层次理解脂肪组织在生理及肥胖、胰岛素抵 抗等病理情况下的功能和调控机制。脂肪组织主要
包括白色脂肪组织(white adipo tissue, WAT)和棕 色脂肪组织(brown adipo tissue, BAT)。WAT 按解
剖位置可分为皮下脂肪组织(subcutaneous adipo
tissue, SAT)和内脏脂肪组织(visceral adipo tissue, VAT), VAT 脂肪的积聚被认为与胰岛素抵抗和代谢
性疾病的风险增加相关，而SAT 脂肪的积累甚至可
能对代谢综合征起到保护作用2】。根据形态和功能, 脂肪细胞可被分为3类，白色脂肪细胞负责脂质的储
存和释放，棕色脂肪细胞因含有大量线粒体和解耦 连蛋白1 (uncoupling protein 1, UCP1)而具有产热功 能，米色脂肪细胞则散布在WAT 中，可响应外界刺激 表达UCP1产生类似于棕色脂肪细胞的功能，且白色
和棕色脂肪细胞来自不同的发育起源W 在细胞 成分上，除成熟脂肪细胞外，脂肪组织还包括脂肪前 体细胞(adipocyte precursor cells, APCs)、前脂肪细
胞、免疫细胞、内皮细胞和血管祖细胞等多种细胞
类型，统称为基质血管成分(stromal vascular fraction,
SVF)O 脂肪组织的异质性不仅体现在解剖位置和复
杂的细胞成分上，即使是同一脂肪组织的脂肪细胞
胡帆等：单细胞测序技术在脂肪组织研究中的应用
2283
也存在异质性。例如，同一小鼠WAT 中存在对炎症
细胞因子、胰岛素和生长激素响应能力不同的脂肪 细胞群体，人脂肪祖细胞中也发现了分子表型和代
谢表型不同的亚群X)；同一棕色脂肪组织中，肾上 腺素刺激时，脂肪细胞线粒体膜电位和UCP1激活水
平呈现出异质变化W 上述对脂肪组织异质性的研 究在方法学上多数采用遗传示踪和流式细胞术，由 于只选择有限的基因产物来标记和追踪细胞，结果
存在偏倚且难以获得全面的信息，因此，尽管在一定 程度上揭示了脂肪细胞种类和功能的异质性，但对
脂肪细胞谱系动态、发育机制、细胞亚型的详细分 子描述和具体代谢表型尚未完全阐明。
单细胞转录组学技术应运而生，使得对成千上 万个细胞进行单细胞mRNA 测序(single cell RNA
quencing, scRNA-q)jS ；为可能。通过新的聚类、可
视化和建模算法，在鉴定关键的细胞亚群和状态，推 断细胞分化轨迹中具有明显优势，实现了在单个细
胞水平上全面、无偏倚地评估细胞异质性和功能状 态叫本文将单细胞测序技术应用于脂肪组织的研 究进行总结，从而为在脂肪组织研究中更好地利用 这一技术提供思路。
1脂肪细胞的异质性分析
目前关于脂肪细胞异质性分析的单细胞研究 主要集中于APCs，少数为成熟脂肪细胞。
由于成熟脂肪细胞富含脂滴，体积较大，早期 的scRNA-q 技术难以对其进行分析。近期出现的 单细胞核RNA 测序⑸ngle nuclei RNA-quencing,
snRNA-q)，通过分析细胞核的转录本水平，使成熟
脂肪细胞在单细胞层面的研究得以开展。scRNA-
q 和snRNA-q 技术是否可以获得一致性结果，尚
存在争议㈣。下文将对两种技术应用于APCs 和成
熟脂肪细胞的研究进行阐述。
1.1 APCs 异质性的细胞图谱
既往研究普遍认为，WAT 中的脂肪祖细胞表
达常见祖细胞或间充质细胞表面标志物如PDGFa 、
CD34和SCA-1 (Ly6a), PDGFp 在某些条件下也有助 于脂肪细胞的形成［"-，5,o 但细胞群体之间的重叠、 异质性和发展相互关系尚未完全了解。关于脂肪祖
细胞的scRNA-q 研究一般通过这些表面标志物对
SVF 细胞进行分选，以描绘脂肪祖细胞的分子图谱 (图1)，研究不同亚群的功能特点(表1)。
1.1.1皮下脂肪组织APCs 的多样性 尽管2017年
ACOSTA 等"噌报道，人SAT 中APCs 由单一同质的
细胞群构成，但该研究分析的细胞数量有限("=381),
因此难以评估异质性。随后，SCHWALIE 等"进行 了第一个小鼠WAT 的单细胞测序研究，发现在1±1一
(CD3「CD45「TER119「)CD29*C D34+SCA-1+ SVF
中至少存在3个亚群，其中P1亚群表达干细胞特异
性基因(CD34和。6a), P2亚群表达前脂肪细胞基 因(用BP4、PPARG 和CD36), Pl 、P2亚群分别处
于脂肪细胞分化阶段的两极，占所有亚群的90%。 另一个既往无法识别的亚群P3主要表达CD142和
ABCG1，该亚群缺乏成脂能力且能够抑制其他细 胞成脂，故被称为脂肪形成调节细胞(adipogenesis-
regulatory cells, Aregs)o 该研究首次提供了存在抑
制性APCs 的证据，并强调其在成脂过程中发挥负调
控作用的重要机制。MERRICK 等阴对小鼠腹股沟 白色脂肪(inguinal white adipo tissue, iWAT)来源
的SVF 进行单细胞测序，鉴定了DPP4S ICAM1+和
CD142T 个主要亚群。DPP4+亚群具有更强的增殖
能力和多向分化能力，在体外培养条件下向脂肪分
■ ■' Progenitor Pl (CD34, Ly6a), Groupl (DPP4, Wnt2, Bmp7)
Preadipocytes
Adipogenic APCs P2 {FABP4, PPARG, CD36), Group2 (ICAM1, PREFI. PPARG,
FABP4, CD36)
Group3 (CD142, Cleclla, Fmo2\ APCs lLy6UCD9~PDGFR0冷
Anti-adipogenic APCs Aregs {CD142, ABCG1\ FIPs (Ly6C, PDGFAB)
SVF：基质血管成分;APCs：脂肪前体细胞；Aregs：脂肪形成调节细胞;FIPs：纤维-炎症祖细胞。
SVF: stromal vascular fraction; APCs: adipo precursor cells; Aregs: adipogenesis-regulatory cells; FIPs: fibro-inflammatory progenitors.
图1脂肪前体细胞的异质性
Fig.l Heterogeneity of adipo precursor
cells
2284.综述.
表1脂肪组织中单细胞转录组的硏究总结
《草房子》读后感Table1Summary of studies that characterize the single-cell transcriptome in the adipo tissue 方法技术分选策略物种样本来源参考文献Method Technique Sorting strategy Species Depot Reference scRNA-q lOx Genomics PDGFRP
*Mou VAT[19] scRNA-q lOx Genomics SCA-TCD31_CD45_TER119Mou VAT[20]
scRNA-q lOx Genomics CD45，Mou VAT[34]
scRNA-q inDrops CD45CD3T PDGFRa'SCA-T PDPN
*Mou VAT[31] scRNA-q Fluidigm CI and Lin_(CD3rCD45_TER119_)CD29+CD34"Mou SAT[17]
lOx Genomics SCA-1
*
scRNA-q Fluidigm Cl Not mentioned Human SAT[16]
snRNA-q and Smartq2and I Ox Not mentioned Mou BAT[28]
scRNA-q Genomics Human
snRNA-q and lOx Genomics and Not mentioned Mou SAT[26]
scRNA-q Drop-q
scRNA-q lOx Genomics Not mentioned Mou BAT[27]
scRNA-q lOx Genomics Lin'[CD45_CD45R'CDllb~Grl(Ly6Cl/C)_Mou SAT[23]
TER119_]/Lin'VAT scRNA-q lOx Genomics Depletion CD45'Mou SAT[18]
Human
scRNA-q lOx Genomics CD45
*Mou VAT[32] scRNA-q1Ox Genomics CD347CD34-Mou SAT[25]
Human EAT
SAT：皮下脂肪组织;VAT：内脏脂肪组织;BAT：棕色脂肪组织。
SAT:subcutaneous adipo tissue;VAT:visceral adipo tissue;BAT:brown adipo tissue.
化的能力较弱，给予TGF-P可完全抑制其向脂肪分化;ICAM1+和CD142+亚群在胰岛素刺激下即可分化为成熟脂肪细胞。在基因标志(gene signature)上，上述3个亚群分别与SCHWALIE等报道的Pl、P2 和P3亚群对应，两项研究均发现，与iWAT相比，附睾旁白色脂肪组织(epididymal white adipo tissue, eWAT)的SVF中含有更高比例的CD142或Aregs(P3)亚群，并且肥胖可使其比例增加。尽管CD142+亚群与Aregs亚群基因标志相似，但功能相反，这种差异可能源于两项研究中FACS的策略不同⑴)。
1.1.2内脏脂肪组织APCs的多样性小鼠附睾旁白色脂肪组织PDGFRp+的细胞中也发现了功能上类似于Aregs的亚群，该亚群高表达Ly6C，体外实验发现，其几乎不具有分化为脂肪细胞的能力，并可抑制其他APCs分化为脂肪细胞。同时该亚群高表达促纤维化和炎症相关基因，可促进纤维形成和炎症发
生，因此被称为纤维-炎症祖细胞(fibro-inflammatory progenitors,FIPs)。另一亚群Ly6C_CD9~PDGFRP"则具有较强的成脂能力，被称为APCso高脂饮食条件下，FIPs亚群表现出相对较强的增殖能力，比例显著增加。值得注意的是，HFD可促进APCs亚群中IL6、TNFa、Col l ai,Col3al等基因的表达，提示在肥胖等外界刺激下，体内APCs亚群具有触发炎症反应的潜力T。该研究揭示了eWAT中APCs的功能异质性，FIPs亚群的发现有助于探索WAT重塑和导致代谢功能障碍机制的研究。在另一项研究中，高脂饮食诱导的肥胖小鼠Lin-SCA-1+的细胞中脂肪干细胞和前脂肪细胞占比与普通饮食小鼠相似，但其中抑制脂肪分化的亚群比例增加，促进脂肪分化的比例减少。此外，该研究利用各亚群细胞的表面标记CD55、CD81和CD9，与传统的脂肪干细胞和前脂肪细胞标记结合使用，为分离和研究肥胖下的APCs亚群细胞的功能提供了新的策略
1.1.3SAT和VAT中APCs的异同卩3肾上腺素受体((33-adrenergic receptors,ADRB3)激活时，eWAT中表达PDGFa的脂肪干细胞增殖并分化为新的米色脂肪细胞，而ADRB3激活几乎不引起iWAT中PDGFRa 细胞增殖或新生脂肪形成，大多数米色脂肪细胞源于己有的白色脂肪细胞［2|'22)=为此，BURL等呦利用scRNA-q对［3肾上腺素受体激动剂(CL-316243)诱导的脂肪组织重构进行研究，发现iWAT和eWAT均由ASC1和ASC2亚群组成，但两者占比不同，eWAT
胡帆等.单细胞测序技术在脂肪组织研究中的应用
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Lipid respons
Adipokine cretion
White adipocytes
Insulin pathway
单亲家庭的孩子Brown adipocytes
Inhibit thermogenesis
BA-L
Tliermoncutrality
BA-H
Cold
BA-L：低产热活性棕色脂肪细胞;BA-H：高产热活性棕色脂肪细胞。
BA-L: brown adipocytes with iow thermogenic activity; BA-H: brown adipocytes wim high thermogenic aciiviry.
图2成熟脂肪细胞的异质性(根据参考文献[27]修改)
Fig.2 Heterogeneity of mature adipocytes (modified from reference [27])
主要由ASCI 组成,iWAT 则主要由ASC2组成。卩肾 上腺素受体激动剂处理3天时，iW\T 中上调的脂肪 从头合成的基因数少于eWAT，表明受到肾上腺素
能刺激时,eWAT 更容易进行脂肪从头合成。最近,
OGURI 等"I 对LiiT SVF 进行单细胞测序发现,CD81 作为iWAT 中米色脂肪祖细胞的标记物，而且在调控 米色脂肪细胞增殖和全身能量稳态中也发挥重要作 用。另外，利用在eWAT 中鉴定的FIPs 亚群的表面标
志物Ly6C +PDGFRp +，未能在iWAT 中分离出相应亚
群时叫提示和eWAT 的分选策略并不一定通用, 也证实SAT 和VAT 细胞亚群的分布异质性。SAT 和
VAT 共同存在的亚群也有报道，例如，在肥胖人群的 SAT 和VAT 中既存在表达与脂肪细胞分化相关基因 CFD(complement factor D)的亚群，也存在VAT 特异的 亚群，该亚群起源于间皮细胞且具有线粒体活性和 向米色脂肪细胞分化的潜能。尽管尚不清楚这种米
色脂肪祖细胞在肥胖个体VAT 中存在的生理意义，但
其可能作为一种代偿机制，减轻肥胖对机体的不良 影响
1.2成熟脂肪细胞的异质性图谱
白色脂肪细胞功能的多样性并非由同一细胞群 体执行不同功能所致，而可能是通过功能不同的多
种细胞亚群实现。RAJBHANDARI 等利用snRNA-
q，发现寒冷或卩肾上腺素受体激动剂处理时，成熟 白色脂肪细胞中除了存在具有产热活性的亚群，还
可细分为负责脂肪组织发育、脂肪因子分泌、胰岛 素信号传导、脂质合成和运输等不同功能的亚群。 既往认为，成熟棕色脂肪为高度同质化的细胞。最 近两项研究发现，棕色脂肪细胞在产热能力上也具
有异质性©J%图2)。小鼠BAT 中可以同时存在两种 产热活性的脂肪细胞，低产热活性的棕色脂肪细胞
(brown adipocytes with low thermogenic activity, BA-L)
和高产热活性的棕色脂肪细胞(brown adipocytes with
high thermogenic activity, BA-H)，并且能够相互转化,
在寒冷环境下BA-L 转化为BA-H，而在热中性条件下 则相反(图2)。BA-H 棕色脂肪细胞也可进一步细分 为负责线粒体合成、胰岛素响应和脂肪产热等各个 亚群，但BA-L 亚群的功能和谱系以及调节BA-H 和
BA-L 两亚群之间相互转化的分子机制有待明确。抑 制产热的棕色脂肪细胞也通过snRNA-q 得以发现。
SUN 等购首次对小鼠和人类棕色脂肪细胞同时进行
单细胞分析，发现了一类新的抑制产热的棕色脂肪 细胞，该亚群在寒冷、室温、热中性条件下逐渐增加,
即冷刺激下该群体的细胞比例减少，而在缺乏交感 神经输入的情况下比例增加，同时在人颈部脂肪组 织中比例更高，该发现能够部分解释人类BAT 的活
性远低于小鼠，另外，对该亚群细胞进行干预可能有 利于恢复人BAT 的产热活性凹。
2免疫细胞与脂肪细胞的交互调控作用
分析
2.1 T 细胞与脂肪细胞的交互作用
脂肪组织浸润的免疫细胞在脂肪组织功能障碍
影响代谢性疾病的发生和发展过程中起着重要作用。
VUAY 等㈤描绘了肥胖人群脂肪组织免疫细胞图谱,
发现在14种免疫细胞亚群中，一群高表达金属硫蛋白
中国文明网留言基因的CD8+T 细胞可能与肥胖相关。这些金属硫蛋 白基因仅在潜在功能障碍的T 细胞中表达，而在活化
2286.综述.
Lean Obesity
Treg：调节性T细胞。
Treg:regulatory T cell.
图3免疫细胞与脂肪细胞间的调控(根据参考文献【31]修改)
Fig.3Crosstalk between immune cells and adipocytes(modified from reference[31])
的记忆CD8+T细胞中不表达，为T细胞在脂肪组织炎症和胰岛素抵抗中的作用提供新的机制。既往研究报道,Foxp3+CD4+调节性T细胞对抑制V/YT炎症和代谢异常具有重要作用，该作用的发挥高度依赖于细胞因子IL-33，但IL-33的来源存在争议（29创。SPALLANZANI等的通过scRNA-q确定，VAT中IL-33源于特定的间充质基质细胞亚型，该研究突出了特定基质细胞亚群在调节脂肪组织免疫细胞稳态中的作用（图3）。此外，一些比例相对较小的免疫细胞在脂肪组织中的作用也得以揭示。有研究报道，短期生酮饮食带来的益处与VAT中RT细胞数量增加、抑制炎症有关，显示出2T细胞在改善脂肪组织炎症和维持代谢稳态中的重要性阳。
总角是什么意思2.2巨噬细胞与脂肪细胞的交互作用
除T细胞以外，脂肪组织巨噬细胞（adipo tissue macrophages,ATMs）在肥胖和胰岛素抵抗发生过程中涉及的能量代谢、清除死亡脂肪细胞和胞外脂质方面起着关键作用列。最近两项单细胞测序研究
进一步证实了ATMs这一作用。肥胖时，小鼠VAT中高表达4poe和Sepp/的巨噬细胞亚群增加，热量限制后该亚群数量减少，同时促进与清除死细胞和过量脂质相关的ATMs亚群增加列。在激活ADRB3脂肪组织重构时，高表达脂质摄取、细胞外基质重构和蛋白水解相关基因的ATMs亚群增加，该亚群分布在脂肪细胞生成的微环境中，其功能与清除脂肪细胞和促进脂肪干细胞向米色脂肪细胞分化有关⑷。另外两项对肥胖小鼠和人群的单细胞测序研究均报道了一种与炎症相关的CD9型巨噬细胞的存在，表明CD9
*ATMs可能是与肥胖相关的独特类型3切（图3）o上述研究提示，过去通过流式细胞术和全组织转录组分析，只能够将巨噬细胞简单地分为Ml和M2型，并可能遗漏一些关键信息，而单细胞测序技术的应用可使巨噬细胞亚群分类和功能更为精细。
2.3分泌特定细胞因子的免疫细胞与脂肪细胞的交互作用
既往研究显示，敲除ZL-"的小鼠在整体水平上产热增强，但能够对IL-10产生应答的具体细胞类型有待明确"1。RAJBHANDARI等通过单细胞测序揭示了产生IL-10的免疫细胞与脂肪细胞之间的对话是调控产热和系统能量平衡的关键因素。由此可见，单细胞测序技术可为研究其他细胞因子在脂肪细胞与免疫细胞对话中的作用和机制提供新的思路。
3脂肪细胞分化的拟时序分析
scRNA-q拟时序分析可以对处于发育过程中细胞的瞬时状态进行表征，其通过特定算法了解基因表达变化的整体“轨迹”，然后将每个细胞放置在轨迹中的适当位置，从而重现细胞重编程的过程并分析这一过程中受调控的关键基因。BURL等删发现，卩肾上腺素受体激动剂处理引起增殖型和分化型的脂肪干细胞亚群增加，对这两群细胞进行拟时序分析，发现可分别对应干细胞增殖、早期成脂分化和晩期成脂分化三个阶段，清晰地重现了脂肪干细胞向米色脂肪细胞分化的轨迹，并鉴定了多个与分化轨迹相关的基因。拟时序分析对于揭示脂肪祖细胞的发育层次结构具有重要的作用，在早期脂肪形成过程中DPP4+亚群细胞可转变为ICAM1+和CD142+前脂肪细胞，进而分化为脂肪细胞阴，干预这些细胞亚群中的一个或多个群体或可促
进脂肪适
>花的组成
