・论著・基础研究·
丙氨瑞林降低人卵巢癌CoC1/cDDP细胞线粒体膜电位
并诱导其凋亡的研究*
江苏省南通大学附属医院(南通226001)
仲建新 曹新平 王 迪 张 弘 丁润生 姜胜华 江 枫 黄 华 姚 微 史锦云
摘 要 目的：研究丙氨瑞林降低人卵巢癌CoC1/cDDP细胞线粒体膜电位( m)与诱导其凋亡的关系。方法：用不同浓度的丙氨瑞林与Co C1/cDDP细胞一起培养48h，并设对照组。
经瑞士-姬姆萨染色进行细胞凋亡形态学观察；流式细胞仪检测亚G1期细胞、Annex in V+/PI-细胞的百分率及线粒体膜电位( m)的变化；半定量RT-PCR法检测作用前后CoC1/cDDP细胞Caspa-3mRNA的表达。结果:Co C1/cDDP细胞经丙氨瑞林作用后亚G1期细胞及Annex in V+/PI-细胞的百分率较对照组明显升高(P<0.01)，并且出现明显的凋亡细胞形态的改变，而线粒体膜电位( m)降低的细胞数百分率显著增加(P<0.01)，两者间呈正相关关系(r=0.
950,r=0.924,P<0.05);Caspa-3m RNA的表达较对照组明显增强(P<0.01)，并且与亚G1期细胞、Annex in V+/PI-细胞及 m降低的细胞数均呈正相关关系(r=0.909,r=0.897,r=
0.909,P<0.05)；并且上述变化均与丙氨瑞林的剂量有关(P<0.01)。结论：丙氨瑞林可通过降
比质量低人卵巢癌CoC1/cDDP细胞线粒体膜电位( m)，从而诱导其凋亡。牛头山水库
主题词 线粒体 膜电位 细胞凋亡 @丙氨瑞林 @CoC1/cDDP细胞 @Caspa-3mRNA
Alarelin decread the cell mitochondrial membrane potential and
induced CoC1/cDDP Cell apoptosis
Affiliated Hospital o f Nantong University(Nanto ng226001)
Zhong Jianx in Cao Xinping Wang Di et al浪淘风簸自天涯上一句是什么
ABSTRACT objective:T o st udy t he r elatio nship betw een Co C1/cD DP Cell a po pt osis,w hich w ere induced by A larelin and t he cell mito cho ndr ial m em br ane pot ent ial( m).M etho ds:T he different co ncentr ations o f A larelin wer e ud t o trea t Co C1/cDD P Cell,blank was ud as contr ol in exper iment.T he mor opholog ic chang e of Co C1/cD DP cells w as o br ved by W r ight staining.T he sub-G1、Annex in V+/PI-cell co ntent and the cell mitochondrial membra ne potentia l( m)stained w ith R h123wer e analy zed by flo w cy tom etry(F CM).T he ex pressio n of Ca spa-3m
RN A w as measured by mi-quantitat ive RT-PCR.R esults: Aft er tr eated by A lar elin CoC1/cDDP cell a ppeared the classical apo pt otic mo r pho lo gy,the percentag es o f sub-G1a nd Annex in V+/PI-cells wer e incr ead(P<0.01);the per cent ages of Rh123-cells wer e incr ead(P<0.
01),a nd had a po sitiv e co rr ela tio n w ith the sub-G1and A nnex in V+/P I-cells(r=0.950r=0.924,P<0.05);
the Caspa-3mRN A expr ession w as incr ead and had a positive cor relation with t he apopto tic rat e(r=0.909, r=0.897,P<0.05)and Rh123-cells(r=0.909,P<0.05);the var io usness wer e in a do -dependent manner.Co nclusion T he anti-tumo r effects o f A lar elin on Co C1/cDDP Cells ar e r elated to decr easing the m and then inducing the apo ptosis o f the Co C1/cD DP Cells.
KEY WORDS M itochondria M em br ane po tentials A poptosis @Alar elin @CoC1/cDDP @Ca spa-3mRN A
*南通市科学技术局社会发展指导性计划 虽然促性腺激素释放激素类似物(GnRHa)已应用于激素依赖性肿瘤如乳腺癌、卵巢癌、前列腺癌及子
宫内膜癌等的治疗，但其生物学机制仍不明了。细胞凋亡已成为研究抗癌药物对肿瘤治疗作用的非常
重要的一项措施。本实验利用人卵巢浆液性腺癌耐药的细胞亚株CoC1/cDDP，研究丙氨瑞林诱导CoC1/cDDP细胞凋亡与线粒体膜电位的关系，为丙氨瑞林抗癌作用提供实验依据。
材料与方法
1 卵巢癌耐药细胞系 人卵巢癌顺铂耐药细胞株CoC1/DDP购自中国典型培养物保藏中心，耐药株在实验前无药培养2周后使用，接种于含10%胎牛血清的RPM I1640培养体系中，在37℃、体积分数为5%的CO2、饱和湿度培养箱中培养,2～3d细胞传代一次。取处于对数生长期的细胞用于实验。
2 药品与试剂 丙氨瑞林为安徽丰源药业股份有限公司产品；罗单明123(Rhodam ine123,Rh123)及碘化丙啶(PI)均为Sigm a公司产品;RPM I1640培养液为Hyclo ne公司产品；胎牛血清为Gibco公司产品; Tr izol为上海华舜生物工程有限公司产品;Annex in V-FIT C细胞凋亡检测试剂盒、Ro bus TIRT-PCR试剂盒均为晶美生物工程有限公司产品。
3 细胞培养和药物处理 取对数生长期的细胞，接种各瓶，培养24h后，将丙氨瑞林分组加入，终浓度为10-7mol/L及10-5mol/L各一组；并设一空白对照组(不加药组)。继续培养48h，离心、PBS洗涤收集细胞，待用。
4 流式细胞仪检测 取各组细胞置离心管加PBS洗涤2次,1000rpm离心10min，去上清，吸干后，加
入70%冷乙醇2m l固定于EP管中,-20℃保存，测定前将标本用PBS洗涤2次,1000rpm，离心5m in，加入浓度为0.01%的RN A酶37℃消化30min，再加入100g/ml碘化丙啶(PI)100l，避光孵育30min,300目尼龙网过滤后流式细胞仪检测,CellQuest软件获取10000个细胞,M odFit软件分析计算亚G1期细胞。
Annexin V FIT C标记，流式细胞仪检测细胞早期凋亡：取各组细胞离心，去上清；加PBS调整细胞浓度为5×105/ml，取200l，离心，去上清；加入195l缓冲液(buffer)及5l FIT C-A nnex in-V，避光孵育10m in，离心去上清；加100l buffer洗涤细胞一次，离心，去上清；加入buffer190l及PI10l，避光避光孵育10m in，上机检测Annex inV+/PI-细胞百分率。细胞膜不对称丧失导致磷脂酰丝氨酸(PS)外翻是细胞凋亡的早期事件,AnnexinV可以特征性与PS结合，而被用来检测暴露在细胞表面的PS,PS外翻也可以发生在细胞坏死过程中，两者差别是在凋亡初期细胞膜是完好的，而在细胞坏死的早期阶段，细胞膜的完整性就被破坏了，用碘化丙啶(PI)可以区分膜的完整性。在双变量散点图上，可见三群细胞，即活细胞群(Annexin V-/PI-)、凋亡细胞群(Annex in V+/PI-)、和死细胞群(Annexin V+/PI+)。
细胞线立体膜电位( m)检测：收集各组细胞1×106,PBS洗2次；细胞重悬于500k Rh123(10l/ m l)中,37℃水浴30m in;PBS洗2次，重悬于500l PBS 之中；流式细胞仪检测Rh123-细胞数。Rh123是亲脂阴离子染料，细胞内的摄取量与线粒体膜电位呈正相关，经Rh123染色后，流式细胞仪分析，以Rh123荧光强度做横坐标，在散点图上可见两群细胞，右半象限Rh123+的细胞为线粒体膜电位正常的细胞，左半象限Rh123-的细胞为线粒体膜电位降低的细胞。
5 RT-PCR检测细胞株Caspa-3mRNA表达 采用T rizol一步法抽提总RNA，按说明书操作，并于紫外分光光度计上检测其吸光度A260及A260/ A280比值，以测定提取总RNA量及检定RNA的纯度良好。基因引物序列采用Primer5软件设计,!-actin上游序列:5’-AAGT ACTCCGTGTGGATCGG-3’，下游序列:5’-ATGCTAT CACCT CCCCT GT G-3’; Caspa-3上游序列:5’-GT CGAT GCAGCAAACCT CGG-3’，下游序列:5’-CCT GACACCGTAA CT CTG AC-3’。RT-PCR采用Robus TI RT-PCR试剂盒，按说明书操作。逆转录反应条件:56℃、45min逆转录合成cDNA。PCR反应条件：预变性94℃、3min；变性94℃30s，退火55℃30s，延伸72℃30s，循环40次；最后72℃延伸5m in，得到反应终产物；取10l扩增产物经用1.5%琼脂糖凝胶电泳，溴化乙锭染色，紫外线灯下观察,Caspa-3呈现出317bp条带,!-actin呈现出495bp 条带，与100bp ladder比较；并用凝胶图像分析仪分析,Caspa-3表达指数=Caspa-3值/!-actin值。实验重复3遍，取平均值。
6 细胞形态观察 取加丙氨瑞林(10-5mo l/L)培养48h的CoC1/cDDP细胞，离心、涂片、瑞士-姬姆萨染色，在光镜下观察细胞形态的改变。
7 统计学处理 实验数据以均数±标准差表示；数值统计均用SPSS11.0软件对数据进行方差分析、均数的t检验及相关分析。
结 果
1 流式细胞仪检测丙氨瑞林对CoC1/cDDP细胞凋亡作用的影响 见附表。经丙氨瑞林作用后的CoC1/cDDP细胞亚G1期细胞百分率明显高于对照组，并且与丙氨瑞林的浓度相关(P<0.05)。丙氨瑞林组的Annex inV+/PI-细胞百分率较对照组显著增加(P<0.01)，并且随着丙氨瑞林浓度的增大而升高(P
<0.01)。这一结果与亚G1期细胞相类似。
附表 丙氨瑞林对CoC1/cDDP细胞增殖、细胞
周期及凋亡的影响赵珊珊
组别 对照组
丙氨瑞林组
10-7mol/l10-5mol/l 亚G1 2.85±0.14 16.94±2.50*30.69±1.55** AnnexinV+/PI-4.04±1.16 20.05±1.95*35.12±2.95** Cas pas e-30.233±0.004 0.278±0.004*0.291±0.002**
m 3.13±0.21 20.19±2.78*33.02±2.16** *P<0.01(v s对照组)**P<0.05(vs对照组及10-7 mol/L组)
2 丙氨瑞林对CoC1/cDDP细胞表达Caspa-3 mRNA的影响 见附表。Caspa-3mRNA在丙氨瑞林作用后表达增强，加大丙氨瑞林的浓度,Caspa-3mRNA的表达进一步增强(P<0.01)，并且与亚G1期(r=0.909,P<0.05)、Annexin V+/PI-(r=0. 897,P<0.05)呈正相关关系。
3 细胞形态学观察(瑞士-姬姆萨染色) CoC1/cDDP细胞经10-5m ol/L的丙氨瑞林作用48h 后，离心沉渣涂片，瑞士-姬姆萨染色后，光学显微镜下观察发现细胞出现明显的凋亡细胞形态学改变：细胞胞体变小，胞膜皱缩和泡状突起及不规则凹陷，胞核染色质浓聚、固缩，聚集在核膜周边等。
4 丙氨瑞林对CoC1/cDDP细胞线立体膜电位( m)影响 见附表。研究发现未加丙氨瑞林的对照组中绝大部分细胞为Rh123+，经10-7mo l/l丙氨瑞林处理48h后,Rh123-的细胞数较对照组显著增加(P <0.01)，增加丙氨瑞林浓度Rh123-的细胞数进一步减少，并且与Caspa-3m RNA表达(r=0.909,P<0.
05)、亚G1期(r=0.950,P<0.01)、A nnex in V+/ PI-(r=0.924,P<0.01)呈正相关关系。
讨 论
研究表明促性腺激素释放激素类似物(GnRHa)除通过抑制下丘脑-垂体-性腺轴而发挥抗肿瘤作用外,GnRHa还通过诱导卵巢癌细胞的凋亡，发挥抗肿瘤作用[1]。
本研究采用不同浓度的丙氨瑞林与Co C1/cDDP 细胞作用后，发现Annex in V+/P I-百分率随丙氨瑞林
浓度增加而升高，并显著高于对照组；亚G1期细胞百分率也有类似的变化，呈明显的剂量效应关系。CoC1/ cDDP细胞经丙氨瑞林作用后，光学显微镜下细胞出现明显的细胞凋亡形态学改变：细胞胞体变小，胞膜皱缩和泡状突起及不规则凹陷，胞核染色质浓聚、固缩，聚集在核膜周边等。以上结果提示，丙氨瑞林可诱导CoC1/cDDP细胞凋亡，并且剂量越大作用越强。
随着细胞凋亡分子机制的研究不断深入，人们发现细胞凋亡信号通路主要有两条：即细胞凋亡的线粒体依赖途径和死亡受体途径。近年来细胞凋亡机制研究的一重大突破就是对线粒体重要性的认识，大量实验证实许多因素诱导的细胞凋亡都存在线粒体功能紊乱。已证实，线粒体膜上通透性转运孔(Per meability transition por e,PTP)开放是细胞凋亡的重要环节。正常情况下,PTP只允许相对分子量小于1500的分子通过，质子可自由通过线粒体膜，形成稳定的 m。细胞在致凋亡因子的作用下PT P开放, m降低或丧失，线粒体基质中释放出致凋亡的活性物质如细胞色素C等，这些物质进入胞质，可激活Caspa级联反应，最终导致细胞凋亡[2]。Rho damine123对线粒体膜电位很敏感，其荧光减弱说明线粒体膜电位发生去极化，细胞线粒体膜电位降低[3]。本研究显示,Co C1/ cDDP细胞经丙氨瑞林作用后, m下降(Rh123-)的细胞数显著增加，流式细胞仪直方图左移，随着丙氨瑞林浓度的增加, m下降(Rh123-)的细胞数进一步增加，并且与Annexin V+/P I-细胞、亚G1期细胞百分率呈正相关关系。这些结果表明丙氨瑞林诱导CoC1/cDDP细胞凋亡与 m下降有着密切关系。近年来陆续有报道说明线粒体膜电位的耗散早于核酸酶的激活，也早于磷酯酰丝氨酸暴露于细胞表面。而一旦线粒体膜电位耗散，
细胞就会进入不可逆的凋亡过程[4]。线粒体膜电位改变在丙氨瑞林诱导CoC1/cDDP 细胞凋亡过程中起关键作用。
肿瘤细胞凋亡的信号转导过程中，线粒体在促进凋亡信号和Caspa激活之间起不可替代的作用[5]。有研究表明, m降低主要是由于线粒体膜通透性转运孔(Perm eability transition pore,PTP)的开放，线粒体基质中释放出致凋亡的活性物质，可激活Caspa 级联反应[2]，其中Caspa-3作为关键的执行分子在凋亡信号传导的多种途径中发挥功能[6]。本研究发现CoC1/cDDP细胞经丙氨瑞林作用后Caspa-3mRNA 的表达较对照组明显增强，并且与亚G1期细胞、Annex in V+/PI-细胞及 m降低的细胞数均呈正相关关系。综上所述，丙氨瑞林通过降低线粒体膜电位，而线粒体膜电位的降低，表明线粒体膜通透性转运孔(PT P)的开放，从而释放Caspa的活化物，如细胞色素C、凋亡诱导因子(AIF)等，活化Caspa其中主要Caspa-3，引起细胞凋亡，因此，降低线粒体膜电位，活化Caspa-3可能是丙氨瑞林诱导CoC1/cDDP细胞凋亡的机制之一。
参考文献
(下转第662页)
调节亚单位，决定HIF-1的活性。在许多实体肿瘤的研究中，发现HIF-1呈高度表达[2],Wong等[3]对37例卵巢上皮癌患者癌组织及16例正常卵巢组织中的HIF-1∀和VEGF基因表达水平进行分析，发现卵巢
上皮癌组织中HIF-1∀的表达水平较正常卵巢组织明显增高，而且还发现HIF-1∀的表达水平与肿瘤分期呈正相关。本实验结果表明，用免疫组化检测H IF-1∀蛋白表达水平，正常卵巢组织、卵巢浆液性囊腺瘤、卵巢交界性浆液性囊腺瘤及卵巢浆液性癌高表达率为分别为0、10%、44.4%和65.4%，呈上升趋势。可见HIF-Ia在卵巢肿瘤由良性向恶性转化发展过程中可能起着某种重要的作用。
目前与卵巢浆液性癌预后有关的确定因素包括临床分期、病理分级、组织类型、残留病灶大小和对化疗的敏感性，临床分期是卵巢浆液性癌的独立预后因子。Nakayama等[4]报道HIF-1∀表达既与VEGF和M VD无关，也与卵巢癌患者的预后无关。在52例晚期卵巢癌中Hidekatsu等[5]检测HIF-1∀蛋白的表达率为69.2%,HIF-1∀表达与临床分期、病理分级及组织学类型无关，对术后铂类和紫素的联合化疗有较好的反应率。在本研究中，低分化、III期+IV期和腹水阳性HIF-1∀蛋白高表达，而且HIF-1∀蛋白高表达者的复发或转移率明显高于低表达者，说明肿瘤生长迅速往往导致组织的血液供应不足而发生缺氧坏死，诱导HIF-Ia蛋白的表达。但HIF-1∀不是卵巢浆液性癌的独立预后因素。Kitada等[6]发现在胰腺癌组织中, HIF-Ia表达与细胞增殖相关。Ravi等[7]提出，人类肿瘤组织中HIF-Ia升高与肿瘤血管生成和肿瘤进展相关。抑制肿瘤HIF-Ia的表达可降低肿瘤组织中M VD，抑制肿瘤生长。
综上所述,HIF-1a表达水平在卵巢浆液性癌形成的早期阶段就有升高，并随着肿瘤的进展、病理分级和临床分期的增加、腹水的形成而明显升高，而且HIF-1a 蛋白是卵巢浆液性癌预后不良的因素之一。由于HIF-1a在肿瘤增殖和血管生成中的重要作用，以HIF-1a为靶点的治疗将为卵巢浆液性癌的治疗开辟
一条新途径。
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