-实验研究-利用白消安致BALB/c小鼠生殖毒性建立NOA疾病模型
李慧！王慧芳孟晓丽赵均宋春英郭兴萍
【摘要】目的利用白消安对BALB/c雄性小鼠生殖毒性，建立不同损伤程度的NOA( pox-oOstructive azoospermia,NOA)动物模型。方法本研究取6~8周龄性成熟的BALB/c雄性小鼠共45只，随机分为3组：
0mg/kg组、30mg/kg组、44mg/kg组，每组15只。每2周观察并记录小鼠体重，睾丸和附睾湿重，睾丸体积，及生
精细胞损伤程度。通过HE染色，判断生精细胞受损情况；通过免疫组化技术检测受损生精细胞停滞的减数分裂阶
段，该法主要借助生精细胞减数分裂过程中的三个标记蛋白:STRA8(Stimulated by Retmoic Acid8.STRA8)减数分
裂启动标记蛋白，SCP3(Syaaytoxemai Complep Protein3,SCP3)减数分裂中标记蛋白，TNP1(Traxsitiox Protein-,
TNP1)减数分裂后标记蛋白。结果注射白消安后小鼠存活良好，注射白消安2周时，生精细胞开始损伤，
30mg/kg组轻于40mg/kg组;4周时,44mg/kg组呈唯支持细胞样变化;6-12周时，生精功能开始恢复,30mg/kg组
nba三双排行榜恢复明显快于40mg/kg组；40mg/kg组STRA8、SCP3、TNP1表达在注射4周最低，第8周开始恢复到正常水平。
结论白消安44mg/kg组单次注射4周时，可建立为唯支持细胞型NOA生精障碍模型；单词注射4-2周期间，可
建立损伤程度不同的NOA生精障碍模型，为睾丸组织体外培养提供稳定的研究组织。
【关键词】白消安；BALB/c小鼠；NOA；动物模型
EstabUshment of NOA Modd in BALB/c mice induced by busdfan AA Huiynn12,WANG Hud,MENG XiaolO,
ZHAO Jurf,SONG Chunking2*,GUO Xingpina1*.Departmeni of Biochemistro ang MoleciUao Bioloan,Shanxi MePicai Universita,Taiynaa03000-, Jhina
[AbstrecS]Objective To estaXUsh a NOA(son-azoospermia)animal moOvi with diWerent deyrevs of inju/by
means of busuVax to the/p/Ouctive toxicity of BALB/C male mice.Methodt A total of45BALB/C male mice aged
6-2weeds were randomlu divided into3groups:2my/kg g/op,34my/kg g/op and44my/kg group,15mice in each
g/op.Weight of mice；wet weight of testis and epididymis；msPchlgr velume；and spermamgenic cell damage were
obrved and/corhed eve/9weeds.The damage of spermamgenic cells was determixed by HE staining.By immupohismchemical techpology to detect damage at the stagnatiox of sperm cells meiosis stage,U mainly us three of the
born sperm cells meiosis marher Protein:STRA8(Stimulated by ReXxoic Acid,8STRA8)meiosis start marher Protein；
SCP3(Syaaytoxemai Complep Protein3,SCP3)marher Protein in meiosis,TNP1(Traxsitiox Protein-,T
NP1)marher
Protein after meiosis.Results The mice survived well after the injectiox.After9weeds of the injection,spermatogenic
cells beyan to damage ,and the damage in the30ms/kg g/op was less than that in the40my/kg group■At4weeds,the
40my/kg group showed only supportive cell changes.At6-12weeds,the spermamgenic fuxctiox beyan to recover,and the
recovery was signiUcantlu faster in the34my/kg group than in the44ms/kg g/op.The expression of STRA8,SCP3and
TNP1in the44my/kg g/op was lowest at4weeds after injectiox,and returxed to xormai at8weeds.Conclusion
After a single injection of40my/kg baishangap for4weeds；the moOvi of NOA spermamgenesis disturhapce could be estaXUsheq.During4-2weeds of injectiox,NOA spermamgenic Uisorher mobels with diWerent damage deyrevs could be estaXUsheq ,providing stable rearch tissues for msUcylar
tissue cylturo in vitro.
[Key001x10]busuVax；BALB/c mice；spermamgenic dysfuscPox；animal moOvi
基金项目：山西省重点研发计划项目(251653D34567)
作者单位：53055太原，山西医科大学生物化学与分子生物学教研室、山西省生殖科学研究所(李慧赞)；山西省生殖科学研究所、出生缺陷与细胞再生山西省重点实验室、山西省人类精子库(王慧芳、赵均、宋春英、郭兴萍)；山西医科大学病原生物学教研室(孟晓丽)；
通讯作者：宋春英()；郭兴萍()
不孕症是指一年或以上时间未采取任何避孕措施，性生活正常（每周两次及以上）而没有成功妊娠⑴。有15%的夫妇在育龄期会发生不孕不育，其中有52%为男性不育。其中，无精子症占男性不育原因的22%[2]，包括梗阻性无精症（obstmcdvv azoospermia,OA-和非梗阻性无精症（non-obstmctivv azoospeunia,NOA-。OA患者可以通过附睾或睾丸外科取精获得精子，但NOA患者则失去了获得精子的机会。2211年Tadnyy Sato等提出了两种体外诱导精子发生的方法：一种是器官培养法，将新生小鼠睾丸组织撕成约1mm5大小的组织块，置于35%琼脂糖凝胶上34°C、5%CO2培养箱中培养，获得精子并生育后代⑶；另一种是从未成熟小鼠睾丸分离收集生殖干细胞，将其移植到受体睾丸组织，然后
组织培养，获得单倍体精子细胞，采用显微受精技术获得可育后代⑷。本研究利用白消安对雄性小鼠的生殖毒性及在体修复作用建立不同损伤程度的NOA动物模型，为生精障碍睾丸组织器官培养提供稳定的研究对象，为临床治疗NOA提供理论支持。首先，本研究通过HE染色和Johnn法评估生精细胞损伤程度。接着，通过免疫组化法对受损严重组的生精小管进一步定位，判断损伤组织减数分裂阶段，评估可供组织体外培养的研究时间。
一、材料与方法
1.实验动物:BALB/c小鼠为SPF级实验鼠，生产许可证号:SCXK-1军）2217-P006]，使用许可证号:SYXK-（晋）2015Q001]。所用实验动物为6~8周龄性成熟的BALB/c雄性小鼠，共45只，平均体重约（27±2）g o
根据文献报道[5]，采用NIH、ICR、BALB/c O个品系的小鼠在35mg/kg白消安以上0个剂量组（35mg/kg、46mg/kg、45mg/kg）获得无精子症模型动物。为了更客观的反应白消安的剂量、时间效应，本研究分0mg/kg组、34mg/kg组、40mg/kg组，每组15只，共45只。34mg/kg组每只小鼠单次腹腔注射34mg/kg白消安;44mg/kg组每只小鼠单次腹腔注射44mg/kg白消安;0mg/kg组每只单次腹腔注射lmi生理盐水。
2-主要试剂：白消安（Bpsulfan,B2235,Sigmu；美国），二甲基亚砜（DMSO,D5879,Sigma，美国-,
PBS （P1022，索宝来，北京），鼠卵泡刺激素ELSA试剂盒（48-T,M——，上海），鼠睾酮ELISA试剂盒（48-T, M——-上海）兔抗STRA8多克隆抗体（aU49692, Abcnm，英国）、兔抗SCP0多克隆抗体（aP16090,Abam，英国）、兔抗TNP1多克隆抗体（aU73135, Abcnm，英国）等。
白消安溶液配制：取0.1g白消安溶于17mL DMSO溶液中，将17mgmL的白消安溶液分装于30mL Ephendok离心管中4°C避光保存备用，使用前用灭菌生理盐水稀释17倍（终浓度为1mgmL）。
元旦绘画图片大全二、实验方法
3基本情况：注射白消安当天记为第0天，于注射白消安第2、4、6m周分别取3只小鼠，记录体重、双侧睾丸湿重。
美丽心灵豆瓣2.HE染色：睾丸组织17%甲醛固定，乙醇脱水，石蜡包埋,5^1厚切片,HE染色，在220倍显微镜下观察，采用Johnn法⑷评价精子发生障碍程度，即完好的精子发生为17分；各级生精细胞存在，但排列紊乱为5分；生精小管中有少量精子（5~17个-为0分；无精子，但有许多精子细胞为7分；无精子，仅有少量精子细胞（5-2个-为6分；无精子，但有许多精母细胞为5分：无精子细胞，仅有个别精母细胞4<5个为4分）；仅有精原细胞为0分；无生精细胞，仅有支持细胞为2分；管腔内无细胞为1分。
3.免疫组化：睾丸组织17%甲醛固定，乙醇脱水，石蜡包埋,5R m厚切片，根据抗体说明书步骤完成免
疫组化染片，通过Lecia Applaction Stiue图像系统分别取三个不同位置的平均光密度值进行统计分析。
三、统计学分析
数据经SPSS17.0软件分析，数据服从正态检验，同一时间点白消安处理组与对照组相比用单因素方差分析,P<0.05表示差异有统计学意义。
结果
一、小鼠基本情况
（.与0mg k g组相比,34mg/kg组、3mg k g组小鼠在注射白消安后毛色暗淡无光，部分小鼠背部皮毛脱落明显，耳廓及唇部皮肤颜色与0mg/kg组相比略显苍白，活动减少、慵懒状，进食量减少、饮水量增加。第4周时小鼠体貌特征改变最明显，直至实验结束，实验组小鼠仍没有完全恢复到正常小鼠生理状态。
2.体重与睾丸湿重：注射白消安第2周,34mg/kg 组、44mg/kg组体重减低：44mg/kg组体重下降趋势大于34mg/kg组；第6~17周两组小鼠体重出现恢复，但40mg/kg组恢复慢于34mg/kg组。第2周后30mg/kg组、44mg/kg组睾丸湿重持续下降，且下降趋势明显,6周后睾丸湿重维持稳定，均明显低于
0 mg/kg 组,5具有统计学意义（P <0. 05），如图1所示。
二、HE 染色
注射白消安第2周，生精小管中生精细胞出现 断层样变化，第4周管腔空泡化改变，且44 mg/kg
组损伤最为严重；第6周34 mg/kg 组生精细胞开始
恢复，个别生精小管出现精原细胞，而44 mg/kg 组 生精小管则基本均处于完全空泡化状态；第2~17周
34 mg/kg 组、44 mg/kg 组极少部分生精小管出现精
拔节是什么意思
原细胞（如图2所示）。根据Johnn 评分标准，在
220倍显微镜下分别对0 mg/kg 组、34 mg/kg 组、
44 mg/kg 组的52个曲细精管进行评分，评分越低生
精小管损伤越严重，如表1所示。
三、免疫组化
根据HE 染色及Jobnx 评分结果可知,45 mg/kg 组损伤最严重且损伤持续时间最长，更适合作组织
培养的动物模型。对其进行免疫组化检测，可得与
mg/kg 组相比，注射白消安4周44 mg/kg 组中
STRA8、SCP3的表达最少，TNP1极少表达;6周后 STRA8、SCP3表达开始增加,8周基本接近0 mg/kg
组水平,TNP1少量表达（如图0所示）。
图1白消安对小鼠体重、睾丸湿重的影响
赏月作文Figure 1 The ePect of busulfa/ on the body weight and wot testis weight of mice
表1不同浓度白消安、不同时间点的Johnn 评分(n =52)
Table 1 Johnu scores of diWerent concenWadons of busulfa/ and diWerent time points ( n =54)
Geoup
2W 4W 6W 2W 12W
0 m g/g a 9. 54 ±0. 569. 74 ±0.519. 96 ±0.519. 56 ±0.439. 06 ±9.2334 m/ky
2066±1066
*
3. 74±1.74**
4. 30 ±3 2*
3. 22 ±1.04* 6. 5- ±07 24 *45 m/ky 6. 64 ±0. 56* 2. 06±1.36**
3. 42 ±3 04*
3. 54 ±1.22*
.60 ±2. 12*
STRA8
SCP3
TNP1
0 week 4 weeks 6 weeks 8 weeks
图3 41mg/kg 组不同时间段STRA8、SCP3和TNP1表达情况
Figure 3 Expression of STRA2, SCP3 and TNP1 iu the 41mg/kg grouu a- different /me
periods
讨论
无精子症（azoospermia）是指射出的精液里没有精子，若要得出无精子症的诊断，精液检测应至少进行3次，每次间隔5周以上，所有精液标本离心后沉淀物中未见精子。NOA是曲细精管中，精子发生成
熟障碍导致的无精子症，占无精子症的64%，是男
性不育最严重的类型，主要依靠供精或保养获得后代[42]0本研究旨在建立一种稳定、可靠的生精功能障碍动物模型，为器官培养、细胞培养生精障碍睾丸组织提供稳定的动物模型。裙子英文
常用的去除睾丸生精细胞的方法包括电离辐射、热处理、药物、激素处理以及基因敲除等。电离辐射可以造成各级的生精细胞凋亡，间质和支持细胞损伤,FSH、LH升高6]0热处理主要损伤初级精母细胞60，而激素法所制备无精子症动物模型耗时且不稳定65。截止当前，白消安常用来制作精原干细胞移植模型，但最佳浓度报道不一62270有研究报道, 3个品系小鼠（NIH、ICR、BALB/c）在35mg/kg白消安以上3个剂量组（5mg/kg、47mg/kg、45mg/kg）造模成功获得无精子症模型动物且造模后NIH与ICR、BALB/c小鼠的外观体征表现明显不同,HR和BALB/c小鼠外观体征表现轻微0因此，本研究选用BALB/c雄性小鼠单次腹腔注射34mg/kg^44mg/kg 的白消安来建立生精功能障碍动物模型。
王德志63研究中，小于29mg/kg的白消安不会造成BALB/c小鼠死亡，34mg/kg、40mg/kg、57mg/kg的死亡率可达到为6.5%、86.7%、55%。本研究过程中仅有47mg/kg组中出现5只死亡，经
统计学分析,P> 5.05无差异学统计意义，这一结果与研究报道不符，其可能原因是种属间个体差异,
导致了死亡率的差异，有待于大批量实验动物重复剂量组进行验证。
白消安在损伤生精细胞的同时，有较强的骨髓抑制作用65]，可导致营养不良。本研究中白消安组第2
、4、6、8、15周体重均低于对照组，且第9-7周47mg/kg组体重下降趋势大于34mg/kg组；第6~15周实验组小鼠体重出现恢复，但47mg/kg组恢复慢于35mg/kg组，此结果与文献报道一致。另外，在第2周取样时，肉眼观察发现白消安组睾丸体积小于同期生理盐水组睾丸体积；第7周时实验组小鼠睾丸体积减小二分之一;12周时实验组睾丸体积仍小于对照组，但35mg/kg组恢复状态较47mg/kg组好。这一结果表明白消安可以使睾丸发生萎缩，可能与其生殖毒性、骨髓抑制相关。
白消安作为一种烷化剂，是一种强化疗药，主要通过损伤DNA链来抑制细胞分裂，但不影响DNA的合成6422。因此，具有高度分裂的器官、组织、细胞更易受到白消安毒性的影响，例如睾丸、生精细胞65]0在精子发生过程中，二倍体生殖细胞经过减数分裂过程分化为圆形单倍体精子细胞。所以，白消安的细胞毒性可以使小鼠的生精细胞减数分裂过程阻滞，当白消安对处于G5期的细胞产生毒性后，将抑制下一阶段的有丝分裂65200本研究中注射白消安9周模型鼠睾丸组织HE染色后观察到生精细胞有断裂现象, 7周时34mg/kg组、47mg/kg组生精小管基本都处于空泡化程度，说明生精细胞减数分裂过程被抑制，与报道一致。由于临床常见的非梗阻性无精子症患者中，部分睾丸组织仍有生精功能，因此本研究通过Johnson评分标准对各阶段模型小鼠进行生精功能判定，选择评分为7~5分时间段的动物为疾病模型，作为睾丸组织体外培养研究对象。
STRA5在动物生殖细胞由有丝分裂转变为减数分裂前特异表达，其阳性表达常预示着生殖细胞减数分裂启动,SCP3是联会复合体的重要组件，在减数分裂的过程中起着重要作用，可作为初级精母细胞的
标记蛋白J NP5是精子细胞特异性基因，主要在精子细胞变形阶段表达，标志生殖细胞进入减数分裂后期。经白消安处理后,47mg/kg组4~8周可分别模拟临床上不同损伤程度的NOA患者，在睾丸组织中相关标志物STRA8、SCP3、TNP5水平结合组织学变化，可以清晰的分辨生精功能阻滞在某一阶段，更有利于评价体外培养用睾丸组织的培养效果。研究人员不断探索寻找体外诱导精子发生的途径，主要方式为细胞培养法及器官培养法，但精子发生是一个涉及细胞增殖和分化的复杂过程，需要睾丸组织的特定微环境，尤其是支持细胞6匕因此推断器官培养法比细胞培养法更有利于诱导精子体外发生[22]0SataT.等利用琼脂糖凝胶培养法分别将胎鼠睾丸组织、新生鼠睾丸组织和成熟鼠睾丸组织进行体外培养，发现减数分裂后标志物精子头粒蛋白ACROSIQ和成熟精子标志物GSG9均显著上调表达，证实小鼠睾丸组织中的精
中国生育健康杂志2021年第32卷第3期http：//cjrh.bjmp edu a-251-
原细胞能够被诱导分化成精子［20Q7］。因此，建立稳定且明确阻滞阶段的NOA疾病动物模型，对体外诱导精子发生十分有意义。
综上所述，利用白消安建立BALB/c生精功能障碍动物模型可操作性强、效果稳定、阻滞阶段明确、模型动物存活率高，且以单次腹腔注射46mg/kg 组周期短、损伤久、效果佳。
（图2见封底）三个月宝宝身高
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（收稿日期：2019Q4Q8）
