文章编号:1001-5949(2002)12-0745-02・实验研究・高效液相色谱-紫外光检测法测定血清5-羟色胺
黄建国，徐幸民，印道春
[摘要] 目的 探讨一种新的5-羟色胺(5-HT)检测方法。方法 用高效液相色谱-紫外光检测法
(HPLC-VD)测定32例正常人血清5-HT含量。结果 本法15分钟即可检测出5-HT，且色谱峰分离良好,CV
=1.175%，回收率98.01%。结论 用高效液相色谱-紫外光检测法(HPLC-VD)测定血清5-HT特异性好，灵
敏度高，值得临床科研推广应用。
[关键词] 高效液相色谱法；血清;5-HT
[中图分类号] R446.61 [文献标识码] B
5-羟色胺(5-HT)是机体内一重要的炎症介质，测定血液中的5-HT含量可为多种疾病的诊断和治疗提供依据。本文报道一种简单、快速的血清5-HT高效液相色谱-紫外光检测法。
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1 临床资料
1.1 一般资料：正常对照组选择身体健康的志愿者32例。其中男19例，女13例；年龄21-70岁，平均40.33岁。
1.2 材料
1.2.1 仪器：高效液相色谱仪(慧普化学分析部生产,Series1100型)，包括慧普Hpods不锈钢柱C18, Hypersill5μm(密度),200mm×4.6mm(孔径)，紫外光检测器,Leap Ro2000型计算机(数据处理)及N EC pin writer2000型打印机，超生脱气机(上海Branson,sb2200型)。
1.2.2 试剂及配置:(1)试剂:5-HT标准品(Sigma 公司产品，批号Lot119H1502)，三氯乙酸(TCA)和磷酸二氢钾、冰醋酸(三者均为国产分析纯)，盐酸(为优级纯)用水为重蒸馏水。(2)配置:①5.675 mmol/L5-HT标准储存液：精确称取5-HT标准品(5-HT硫酸肌酐粉)21.98mg溶于10ml的0.1 mmoll/L盐酸溶液中，分成小份置-4℃。②5.675μmol/L5-HT标准应用液：取5-HT标准储存液用0.1mmol/L盐酸稀释1000倍即成，使用当日配置。③0.162mol/L TCA溶液：精确称取10g TCA用水溶解稀释至100ml。④0.1mol/L磷酸二氢钾溶液：称取13.6g磷酸二氢钾用水溶解并稀释至1000ml，用0.45μm滤膜过滤，超声脱气20分钟后备用,p H4.5(命名为流动相1#)。⑤取500ml流动相1#，加入冰醋酸7ml,p H4.0(命名为流动相2#)。自我评价范文
[作者单位]湖南省湘西自治州人民医院，湖南湘西416000
⑥柠檬酸/醋酸缓冲液(Suleiman sasa流动相)[1]：精确称取8.2g无水醋酸钠、2.1ml冰醋酸、4.8g氢氧化钠、10.5g柠檬酸一水化合物，加蒸馏水至1000ml，再用0.45μm滤膜过滤,p H5.1(命名为流动相3#)。⑦取500ml流动相3#加入冰醋酸5ml, p H5.1(命名为流动相4#)。
1.3 方法
1.3.1 色谱分离条件：选择流动相2#，流速1.0 ml/min，进样量为20μl(进样针进样)，室温，紫外光波长λ=275nm，压力226bar，灵敏度23。
1.3.2 血清5-HT测定：每晨8时统一静脉抽血分离血清，取血清1份置有盖塑料小离心管内，加0.612mol/L TCA溶液1ml，于涡旋混合器上混合30秒，放置10分钟后,3000r/min，离心5分钟，取上清液作色谱分析。
1.3.3 定性和定量:5-HT色谱峰用峰保留时间比较法和峰叠加法定性，采用内标法测峰面积定量。2 结果
2.1 色谱分离及保留时间：标准液和血清标本中的5-HT峰分离良好，未见其它杂峰。5-HT的峰保留时间为1
3.69分钟(s=0.1698min,CV=1.12%, n=10)，见图1
。
图1 HPLC色谱图
2.2 标准曲线：取5-HT标准储存液以0.1mol/L
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盐酸系列，稀释成2、20、40、80、160
μg/ml ，分别进样20μl 测定，以峰面积积分数对5-HT 浓度作图，见图2
。
图2 标准曲线
可见两者线性关系良好，标准曲线的回归方程
是Y =1501.19+6398.07x ,r =0.9999，线性范围是
0.1-240
μg/ml ，在本实验条件下,5-HT 最低检测限为1
μmol/L (1ng/ml )。2.3 重复实验：取两种不同浓度的5-HT 标准液各
连续进样测定10次,CV =1.175%。2.4 回收实验：取3种不同浓度的5-HT 标准液及血清标本进样测定，计算其平均回收率为98.01%。2.5 流动相及流速的选择:(1)本实验比较了4种流动相对测定结果的影响(流速定在1.0ml/min ，灵敏度23)，发现流动相1#、流动相3#，分别在50分
钟、78分钟内不出现5-HT 色谱峰，而流动相2#、
流动相4#
，则分别在13.785分钟、16.795分钟出现
5-HT 色谱峰。(2)本实验还选择了3种不同流速
对5-HT 色谱峰的影响，发现流动相2#、流动相4
#
关于滑雪的作文在0.5ml/min 时50分钟内均不出现5-HT 色谱峰;赚钱的职业
但随着流速增加，而色谱峰保留时间缩短，于1.5ml/min 时则分别在12.28分钟、16.04分钟出现5-HT 色谱峰。(3)本试验选择流动相2#及流速1.0ml/min ，使每份标本在15分钟左右即可完成测定。2.6 紫外光波长的选择：根据文献报道[2]
,5-HT 最大吸收波长为275nm (紫外光)，以此测得5-HT
标准液和血清标本中5-HT 峰面积积分为100%,
将其他波长条件下测得的相同标准液及血清标本中的5-HT 峰面积分与其进行比较，发现:①5-HT 标准液，峰面积分别为6191(73%,λ=225)、8482(100%,λ=275)、6615(78%,λ=325);②血清标本，峰面积分别为114104(75%,λ=225)、152139(100%,λ=275)、112582(73%,λ=325)。故在本试验条件下选用275nm 波长最为适宜。
2.7 正常对照组血清5-HT 含量：正常人32例，测
出的血清5-HT 含量 x ±s =387.93±95.65μg/L 。3 讨论
随着5-HT 研究的深入，其研究方法也越来越
迅雷bt种子多，主要有生物法、放射免疫法、荧光法、高效液相层析法[3]。早期生物法现已不用，而放免法虽有较优灵敏度和特异性，但5-HT 的同位素标记和抗血清的制备须具有一定的条件，且对人体有害，故在临床和研究中受到限制。荧光法使用较多，但操作麻烦，需反复萃取,5-HT 容易损失，且在读数时荧光值不停闪烁，存在一定偏差。高压液相层析法简便快速，选择性好，灵敏度高，是一种较好的方法。目前国内报道[3,4]，测定5-HT 的高效液相色谱法主要为高效液相谱-电化学检测法(HPLC -ECD )和高效液相色谱-荧光检测法(HPLC -FD )，然而国内外高效液相色谱仪中含紫外光检测仪的多，前两样色谱仪比后者要昂贵得多。
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本实验选择高效液相色谱-紫外光检测法测定血清5-HT ，国内外尚无类似报道。本方法操作简单，流动相简单易配，价格低廉无毒性，又不需要调节p H 值，设备单一，灵敏度高和特异性比较好,15分钟左右即可完成检测，因而更适合于临床科研工
作中大批标本的检测。
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我们的实验结果显示，正常人血清5-HT 含量
为387.93±95.65μg/L ，低于唐爱国等[4]用HPLC -FD 测定的正常人血清5-HT 18.714±2.948
μmol/L ，高于黄建国等[5]用荧光分光光度法测定的血清5-HT 含量124.90±84.19
μmol/L 。可能与实验方法的差异有关。
[参考文献][1] Suleiman Sasa ,C Leroy Btank ,David C Wenke ,et al.Liquid chro 2
matogrophic determination of retonin in rum and plasma [J ].Clin Chem ,1978,24(9):1509-1514.
[2] 李发美.医药高效液相色谱技术[M ].北京：人民卫生出版社,
1999.69-190.
[3] 黄建国，李桂明.5-羟色胺与皮肤病[J ].皮肤病与性病,1999,
21(3):13-16.
[4] 唐爱国，王继贵，胡赛琴，等.高效液相色谱-荧光检测法检测血
清5-羟色胺[J ].湖南医科大学学报,1996,21(5):119-421.
[5] 黄建国，李桂明，兰雁飞.荨麻疹患者血清5-羟色胺测定及其
临床意义[J ].中国皮肤性病学杂志,2000,14(5):298-299.
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[收稿日期]2002-01-04 [责任编辑]马兴忠
