液质联用技术在测定浮游植物色素与
粒级分类中的应用
张晶晶1，2，3，刘东艳1，4，孙慧慧4，王晓峰1，
2
（1.中国科学院烟台海岸带研究所中国科学院海岸带环境过程与生态修复重点实验室，山东
烟台264003；
2.中国科学院大学，北京100049；
3.鲁东大学资源与环境工程学院，山东
烟台264025；
4.华东师范大学河口海岸学国家重点实验室，上海200062）
摘要：本研究为探讨液质联用技术在测定黄海浮游植物特征色素含量与粒级分类中应用的可行性，在黄
海47个站位取表、中、底三层水样进行了分析，对比了超高效液相色谱（UHPLC ）和超高效液相色谱串联三重四级杆质谱（UHPLC-MS/MS ）
两种仪器的色素检测结果。研究发现UHPLC-MS/MS 的灵敏度更高，但多数情况下两种方法检测结果吻合度较好，均适用于黄海色素样品的测定。叶绿素a （Chl a ）浓度和浮游植物粒级结构空间分析结果显示，山东半岛近岸和长江口东北侧海域，Chl a 浓度较高，小型浮游植物占优势；黄海冷水团海域，Chl a 浓度较低，微型和微微型浮游植物比例明显升高。该航次的Chl a 绝对浓度和不同粒径浮游植物的贡献率与历史数据相比存在一定差异，这与调查时间、站位以及粒级分析方法的差异
有关，需进一步比较研究。关键词：黄海；Chl a ；浮游植物特征色素；粒级结构；UHPLC-MS/MS
中图分类号：X834
文献标识码：A
文章编号：1001-6932（2018）
02-0158-08收稿日期：2017-03-10；修订日期：2017-09-28
基金项目：科技基础性工作专项（2014FY210600）；国家自然科学基金（41376121）；山东省自然科学基金委杰出青年基金项目（JQ201414）。
作者简介：张晶晶（1983-），博士研究生，主要从事海洋生态学研究。电子邮箱： 通讯作者：刘东艳，博士，教授。电子邮箱：u.edu
Application of UHPLC-MS/MS in determination of the phytoplankton
pigment and size fraction
ZHANG Jing-jing 1,2,3,LIU Dong-yan 1,4,SUN Hui-hui 4,WANG Xiao-feng 1,2
渊1.Key Laboratory of Coastal Environmental Process and Ecological Remediation of CAS,Yantai Institute of Coastal Zone Rearch,
Chine Academy of Sciences,Yantai 264003,China;2.University of Chine Academy of Sciences,Beijing 100049,China;
3.Department of Resources and Environmental Engineering,Ludong University,Yantai 264025,China;
4.State Key Laboratory of Estuarine and Coastal Rearch,East China Normal University,Shanghai 200062,China冤
Abstract ：In order to explore the feasibility of applying ultra -high performance liquid chromatography tandem triple
quadrupole mass spectrometry (UHPLC -MS/MS)on pigment analysis and size fraction monitoring,awater samples collected from 3different water layers at 47sites in the Yellow Sea were analyzed,it in terms of pigment concentrations
acquired by ultra-high performance liquid chromatography (UHPLC)and UHPLC-MS/MS respectively and results got from
the two ways were compared.No obrvious differences were obrved from the result comparisons between the two methods for most cas although UHPLC-MS/MS were more nsitive,and the two methods were both suitable for pigment detection in the Yellow Sea.Bad on the pigment results provided by UHPLC-MS/MS,the spatial distribution of chlorophyll a (Chl a )and size fraction were studied.The concentration of Chl a was much higher in the northeast of Yangtze River mouth and
coastal waters of Shandong Peninsula,where micro phytoplankton was the dominant size fraction.The concentration of Chl a was much lower in the central Yellow Sea,and the contribution of nano-and pico-phytoplankton incread significantly in
Doi ：10.11840/j.issn.1001-6392.2018.02.005
海
洋通报
MARINE SCIENCE BULLETIN
Vol.37袁No.2
April.2018
第37卷第2期圆园18年4月
2期
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浮游植物是海洋中最重要的初级生产者，约占全球初级生产力的50%，其群落结构变化不仅影响到海洋初级生产力、食物网、元素生物地球化学循环与气候调节等多个过程，还可导致藻类灾害增多，对海洋生态安全和社会经济造成损害（Roemmich et al ，1995；Field et al ，1998；Sabine et al ，200
4）。因此，研究浮游植物群落结构的变
化规律具有重要的生态学意义。浮游植物按照粒
径的大小可以分为3大类：小型浮游植物（20~
200滋m ）、微型浮游植物（2~20滋m ）和微微型浮游植物（0.2~2滋m ）（Sieburth et al ，1978，More noet al ，2012；Aiken et al ，2009；傅明珠等，
2010
）。不同粒级结构的浮游植物在不同海域的贡献率不同，例如，小型浮游植物在高营养盐的近岸海域对初级生产力的贡献率较高（Agawin et al ，2000；Magazz俨et al ，1995；李涛等，2007；董燕红等，2009），而微型和微微型浮游植物在部分寡
营养海域贡献率高达80%（Takahash et al ，1983；
Hallegraeff et al ，1984；李佳俊等，2016
）；粒级结构组成的差异会进而对生物地球化学循环过程
以及食物网结构形成影响（Ridgwell et al ，2005；Sarthou et al ，2005；Sunda et al ，2002），因此，浮
游植物粒度组成比例的研究十分重要。
逐级过滤法和特征色素分析法是获得浮游植物粒径组成的主要途径（Roy et al ，2011）。逐级过滤法是将水样用不同孔径的膜进行逐级过滤，
通过检测不同膜中的叶绿素a （Chl a ）浓度，获得
不同粒级浮游植物的生物量。此法现场需3次过滤，检测设备简单，在我国多个海域都有应用（孙军等，2003；李超伦等，1998；黄邦钦等，2006；傅明珠等，2010）。然而，浮游植物的形态多种多样，有些微型和微微型浮游植物是以链状
或者群体形式存在（如中肋骨条藻），过滤时会截留在较大孔径的滤膜上，导致低估微型和微微型
浮游植物的生物量，高估小型浮游植物的生物量（孙军等，2003）。特征色素法是利用浮游植物特征色素进行粒级分类的一种方法（Vidussi et al ，
2001；Uitz et al ，2006
）。特征色素法现场操作简单只需一次过滤，不仅可以进行粒级分类，还可以提供浮游植物功能类群的信息（Moreno et al ，2012），目前得到广泛应用。该方法的计算公式是通过对全球范围内大量现场浮游植物数据进行多元线性回归分析获得，因此在不同海区间使用时，
需要验证与适度调整。
利用高效液相色谱（HPLC ）测定浮游植物特
征色素已经得到了广泛的应用，该方法重复性好、仪器相对便宜，且能够满足大部分现场样品检测（Jeffrey et al ，2006）。但HPLC 法仍存在3个不足，影响了色素定性定量的准确性：1）光谱特征相同或类似的色素，使用HPLC 很难区分（Roy et al ，2011），极有可能出现假阴性或假阳性。在定量分析时，浓度较低的色谱峰极易被其同分异构体、色素降解物和邻近的高浓度色谱峰干扰（Dolan ，2002；Hooker et al ，2009
）；2）无法分辨共流出组分中的不同色素（Jeffrey et al ，1994；Garrido et al ，1998；Airs et al ，2001
），共流出的未知色素组分往往被错认为已知色素（Frassanito et al ，2008；Alvarez et al ，2013
）；3）检测器灵敏度不够，有些含量较低的重要特征色素，例如指示微型浮游植
物的别藻黄素（Allo ）和微微型浮游植物的玉米黄
菜叶简笔画素（Zea ），浓度往往在HPLC 方法的检出限附近（Uitz et al ，2009），定量准确度低。超高效液相色
谱串联三重四级杆质谱（UHPLC-MS/MS ）结合了液相和质谱的优点，在多反应监测模式下，色谱
分离的组分经过二级质谱选择，检测准确度明显高于HPLC ，同一时间洗脱出的不同组分可以分别被提取，不会互相干扰；灵敏度高于HPLC ，可以检测痕量色素成分（Roy et al ，2011）。Zhang 等（2016）在前人研究基础上，建立了14种特征色素的UHPLC-MS/MS 定量检测法，大大缩短了色素检测时间，提高了检测的准确度，灵敏度比传统HPLC 方法提高了10~1000倍。
本研究基于UHPLC-MS/MS 新方法，检测了黄海夏季表、中、底3层浮游植物现场样品；并依
this region.Compared with previous studies,the absolute concentrations of Chl a and contribution of size fractions in our study showed some differences,which may be caud by the differences of investigation time,sites or analytical methods.
Thus,more comparison study is still needed to further probe the reason behind the differences.Keywords ：Yellow Sea;Chl a ;phytoplankton marker pigments;size fraction;UHPLC-MS/
MS
张晶晶等：液质联用技术在测定浮游植物色素与粒级分类中的应用
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海洋通报37卷
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据UHPLC-MS/MS 法测得的黄海浮游植物特征色素数据，分析了黄海夏季浮游植物粒级的空间分布特征。研究目的在于探讨UHPLC-MS/MS 法应用在我国海域浮游植物特征色素分析及粒级分类中的可行性。
1研究区域和方法
1.1研究区域与采样方法
2015年8月17-28日，搭乘国家基金委夏季航次对黄海47个站点水体的浮游植物色素展开了
取样调查，采样站位见图1。由CTD 采水器获取表、中、底3层水样。在弱光下使用直径25mm 的GF/
F 滤膜（Whatman ）过滤500mL 海水，滤膜对
折，吸干水分，用铝箔纸包裹，放入冻存管，存于液氮罐中，用于色素测定。1.2特征色素分析
浮游植物色素样品分别采用Waters Acquity U原PLC 和Thermo Fisher 1250pump-TSQ Quantum Ac原cess MAX UHPLC-MS/MS 进行测定，具体步骤参考
Zhang 等（2016
）的方法。乙腈、甲醇（LC-MS 级）购自Merck 公司；乙酸铵（LC 级）购自Sigma 公司。色素标准品（包括Chl a 、Chl b 、Allo 、Zea 、19’-丁酞基氧化岩藻黄素（But-fuco ）、19’-己酞基氧化岩藻黄素（Hex-fuco ）、硅甲藻黄素（Diad ）、岩藻黄素（Fu原co
）、多甲藻素（Peri ）、青绿素（Pras ）、叶黄素（Lut ）、新黄素（Neox ）和紫黄素（Viol
））购自丹麦水资源与环境研究所；内标8’-Apo-beta-carotenal （Apo ）购自ChromaDex 公司。1.3浮游植物粒级分析
粒级测定采用色素分类法（Uitz et al ，2006）。
选取了7种特征色素用来表征不同的浮游植物类群及其粒级结构（表1）；浮游植物生物量使用Chl a 来表示；不同粒级浮游植物比例分别以小型
浮游植物贡献率（mPF ），微型浮游植物贡献率（nPF ）和微微型浮游植物贡献率（pPF ）来表示，计算公式见表1。
图1采样站位
119毅E 125毅E
120毅E 121毅E 122毅E 123毅E 124毅E 表1色素名称、缩写、英文名称、代表浮游植物类群和浮游植物粒级百分比计算公式（Uitz et al ，2006
）色素名称英文名称（缩写）代表的主要浮游植物类群
电商运营叶绿素a Chlorophyll a （Chl a ）共有叶绿素b Chlorophyll b （Chl b ）
绿藻（青绿藻）
别藻黄素
Alloxanthin
（Allo ）隐藻19’-丁酞基氧化岩藻黄素19’-butanoyloxyfucoxanthin （But-fuco ）
定鞭藻和金藻
19’-己酞基氧化岩藻黄素
19’-hexanoyloxyfucoxanthin （Hex-fuco ）定鞭藻岩藻黄素Fucoxanthin （Fuco ）硅藻
玉米黄素Zeaxanthin （Zea ）
蓝藻和原绿球藻
多甲藻素
Peridinin
（Peri ）甲藻
计算公式
诊断色素加权总和weighted sum of diagnostic pigments （wDP ）
0.35[But-fuco]+1.41[Fuco]+1.27[Hex-fuco]+1.41[Peri]+
0.60[Allo]+0.86[Zea]+1.01[Chl b ]
小型浮游植物百分比microphytoplankton proportion factor （mPF ）（1.41[Fuco]+1.41[Peri]）/wDP
微型浮游植物百分比nanophytoplankton proportion factor （nPF ）（1.27[Hex-fuco]+0.35[But-fuco]+0.60[Allo]）
/wDP 微微型浮游植物百分比
picoophytoplankton proportion factor （pPF ）
（0.86[Zea]+1.01[Chl b ]）
/wDP 160香辣卤牛肉
正常血糖值的标准范围是多少
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结果与讨论
2.1
UHPLC 与UHPLC-MS/MS 实际样品检测结果比较
随机选取了25个站位的表层样品，分别使用
UHPLC 和UHPLC-MS/MS 两种仪器检测样品特征
色素含量，并对10种色素的检测结果进行对比分
析（表2）。发现：1）UHPLC-MS/MS 法可检测到的色素种类明显多于UHPLC 法，例如：UHPLC-MS/MS 法在25个样品中均检出Lut ，但UHPLC 法
均未检出；2）UHPLC-MS/MS 法检测下限明显低于UHPLC 法，例如：UHPLC-MS/MS 法检测到的
Peri 的浓度最小值是0.5mg/m 3，而UHPLC 法检测到的Peri 的最小浓度是9.9mg/m 3。在所有的色素
中，Viol 、Pras 、Allo 、Zea 、Chl b 和Lut 含量均较低，提取液中色素平均浓度小于10mg/m 3，说明一些重要的诊断特征色素在自然样品中含量较低（Uitz et al ，2009）。两种方法检测到样品浓度范围上限值和样品平均浓度差别不明显，平均标准偏差（RSD ）除Chl b 外均小于20%。
为了进一步研究两种方法检测结果的吻合度，
表2UHPLC 和UHPLC-MS/MS 海水样品检测结果对比
色素-3-3平均标准偏差/%UHPLC UHPLC-MS/MS
UHPLC
UHPLC-MS/MS UHPLC UHPLC-MS/MS
Peri 18259.9-1831.30.5-1584.2359.2314.212.6Fuco 25257.4-210.78.4-227.957.159.111.7Viol 325 1.1-2.60.1-2.752 2.310.8Pras 925 2.1-15.30.2-15.2 5.5 5.112.6Hex-fuco 2125 5.4-209.00.2-178.552.254.617.6Diad 1921 4.8-177.8 2.1-160.548.645.816.9Allo 1925 1.7-16.50.1-22.17 6.912.0Zea 1725 1.2-16.00.2-18.977.39.9Chl b 1625 4.1-32.80.8-28.213.811.721.8Chl a 252514.7-946.8
13.8-889.2237.2
238 6.8Lut
25
-
0.01-1.3
-
-
春晚主持词
注：浓度范围和平均浓度均以提取液中的浓度计；平均浓度是UHPLC 和UHPLC-MS/MS 两种方法均可以检测到的样品的平均浓度值。
我们选取两种方法均可以检测到的色素样本，对比分析了检测结果（图
2）。结果表明，两种方法检测到的实际样品色素浓度总体吻合度较高，差异不明显。在色素浓度小于20mg/m 3时，
UHPLC-MS/MS 与UHPLC 检测结果相比，少数样品检测结果偏高，例如Hex-fuco 和Allo ；另外也有少数色素检测结果偏低，如Fuco 和Chl b 。
为了确定色素浓度与UHPLC 法和UHPLC -MS/MS 法检测结果差异的关系，进一步研究了色素浓度与两种方法检测结果标准偏差（RSD
）的关系（图3）。由图3可见，76%的两种方法均可检测到的色素，两种方法检测结果的RSD<20%，说明两种检测方法的整体差异不明显。两种方法检测结果RSD>30%的占可检测到的色素的8%，均出现在色素浓度小于20mg/m 3时，这说明两种方法检测结果差异主要出现在色素浓度较低的时候。
图2UHPLC 和UHPLC-MS/MS 实际样品色素浓度检测结果比较
10000100010010010000
1
10
报销标准
1000
色素浓度UHPLC 法（mg ·m -3
）图3UHPLC 和UHPLC-MS/MS 检测结果标准偏差与
检测浓度的关系
806040200色素浓度/（mg ·m -3
）100
10000
1
10
1000100
Peri Fuco Pra Viol
Hex-fuco Diad Allo Zea Chl b Chl a 8%
16%
76%
RSD=30%RSD=20%Peri Fuco Pra Viol
Hex-fuco
Diad Allo Zea Chl b Chl a 张晶晶等：液质联用技术在测定浮游植物色素与粒级分类中的应用赶小猪
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海洋通报37卷
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在低浓度时，两种方法检测结果产生较大差异的原因可能有两方面：1）仪器偏差，不同的仪器，检测原理不同，检测灵敏度不同，检测结果之间会存在一定的偏差，浓度越低，产生的差异一般越大；2）色素含量较低时，UHPLC 检测定量准确度有可能受基线噪音、邻近色谱峰、未知色素组分和同分异构体的干扰，定量准确度受到一定影响（Dolan ，2002；Hooker et al ，2009；Uitz et al ，2009）。
综上所述，两种方法在检测近岸海域实际样品时，检测结果整体吻合度较高，虽然UHPLC-MS/MS 具有更高灵敏度，但两种色素检测方法均适用于黄海色素测定。
2.2黄海浮游植物Chl a 和粒级结构的空间分布特征
调查期间，整个调查海域Chl a 平均浓度为1.87mg/m 3，变化范围为0.13~15.52mg/m 3。Chl a 浓度空间分布呈现由近岸到离岸、由表层至底层
逐渐递减的趋势（图4）。近岸浮游植物以大粒径的小型浮游植物为主，黄海冷水团海域以小粒径的微型和微微型浮游植物为主。
表层Chl a 浓度变化范围为0.21~15.52mg/m 3
（图4A1），高值区出现在山东半岛东侧近岸海域、苏北浅滩近岸和长江口附近海域（E1：12.14mg/m 3；I2：12.34mg/m 3；K1：15.52mg/m 3），低值区出现
在黄海中部黄海冷水团区域（Chl a 浓度<1mg/m 3
）。
在Chl a 浓度大于1mg/m 3的近岸区域，小型浮游
植物是Chla 的主要贡献者，贡献率达79.43%（图4A2）；在Chl a 浓度小于1mg/m 3的冷水团区域，
微型（45.18%）和微微型（30.91%）浮游植物是
Chl a 的主要贡献者（图4A3、A4）。
中层Chl a 浓度明显低于表层，变化范围为0.13~7.31mg/m 3，呈现明显的近岸到离岸递减的趋势，Chl a 浓度高值区出现山东半岛南侧和苏北浅滩近岸海域（G4：5.28mg/m 3；I2：7.31mg/m 3），
图4黄海夏季Chl a 浓度及浮游植物粒级结构的空间分布特征
383736353433323138373635343332313837363534333231
表层
中层
底层
120124
122120124
122
120124
122
120124宣传卡
122
经度（毅E ）
A1：Chl a （mg ·m -3）
A3：nPF （%3
）
A2：mPF （%）
A4：pPF （%）
B1：Chl a （mg ·m -3）
B3：nPF （%3）
B2：mPF （%）
B4：pPF （%）
C1：Chl a （mg ·m -3）C3：nPF （%3）C2：mPF （%）
C4：pPF （%）
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