果蝇昼夜节律生物钟机制研究进展
包鹃
【摘 要】昼夜节律生物钟包括输入途径、生物钟本身和输出途径.果蝇作为昼夜节律生物钟研究的前沿模式生物需被进一步了解.本文对果蝇昼夜节律生物钟的钟基因、激酶和磷酸酶的调控、两个相互依赖的转录/翻译反馈环路、生物钟细胞和昼夜节律行为进行了综述.
【期刊名称】《生物技术世界》
【年(卷),期】2016(013)005
【总页数】2页(P33-34)
【关键词】果蝇;昼夜节律;生物钟
【作 者】包鹃
【作者单位】广西中医药大学,广西南宁530200
【正文语种】中 文
【中图分类】Q42
生物节律是神经生物学中一个重要的课题，它是生物以内源性的时钟机制维持自身生理和行为过程以适应外界环境而产生的节律性。昼夜节律（circadian rhythm）是其中最常见的一类生物节律，它包括输入途径，生物钟本身和输出途径［1］。输入途径指生物将外界时间信号如光照和温度传入生物钟而同步生物钟的过程。生物钟本身有两种，分别是位于下丘脑视交叉上核（suprachiasmatic nucleus，SCN）的中枢生物钟和位于外周组织和器官中的外周生物钟。输出途径是指生物钟将时间信号传到特定的外周组织，从而产生生理和行为节律的过程［2］。
研究昼夜节律的机制对提高人类健康至关重要。现代社会中很多人都有内部生物钟和外部环境失同步的现象，形成的原因有倒班，跨时区飞行等。这种生物钟紊乱已被证实引起情绪和睡眠障碍，认知障碍，新陈代谢异常，并与心血管疾病和精神障碍息息相关［2］。
1971年Konopka和Benzer发现了果蝇的第一个昼夜生物钟基因period，从此开辟了昼夜节
促织原文及翻译
律研究分子机制时代［3］。果蝇作为研究昼夜节律生物钟最前沿的生物，得益于它的可操作性强，传代时间短，快速得到突变体，生物钟基因与哺乳动物生物钟基因高度相似等特点。
昼夜节律生物钟的分子机制是基于一系列基因及其蛋白所构成的两个相互依赖的转录/翻译反馈环路。日间基因clk（clock）和cyc（cycle），夜间基因per（period，tim（timeless），cwo（clockwork orange）。CLK和CYC蛋白驱动per、tim和cwo基因的转录，从而抑制所有晚间基因的转录［4］。基因per有PAS结构域，而与之协同作用的tim基因没有PAS结构域［5］。Per基因和tim基因的转录高峰都出现在ZT14，而它们的蛋白质在ZT19达到生成高峰。（ZT（Zeitgeber time），授时因子（Zeitgeber）是光，在12：12光照黑暗周期中ZT0代表光出现，ZT12代表光消失）其它钟基因如DBT（doubletime）基因，有助于PER的积累。
ls-tim和s-tim 是tim基因的两个等位基因形式。ls-tim序列有两个AUG起始密码子，所以可以表达L- TIM1421和S-TIM1398蛋白。s-tim可以编码S-TIM1398蛋白，但是由于缺失了一个碱基而不能产生L-TIM1421蛋白而是产生一个19个肽的残基。这个突变可以用来设计PC
R的特异性引物来测定tim基因型［6］。Tauber等人还发现含有ls-tim基因的果蝇对光比较不敏感［6］。
对写法磷酸化对调控生物钟震荡机制的稳定性起着不可或缺的作用。例如，磷酸化的PER和TIM很容易降解，所以它们的蛋白比mRNA的高峰延迟6小时。磷酸酶PP2A（Protein phosphata2a）和PP1A（Protein phospata1a）也可调控PER和TIM［7］。
最重要的激酶是SGG（Shaggy），它能加速TIM进入细胞核，而磷酸激酶DBT（Doubletime）调控PER的稳定性［8］。此外，磷酸激酶CK2（Cain kina2）和NEMO（Nmo）也对控制生物钟蛋白的稳定性和进入细胞核起作用，但是它们的作用机制还鲜为人知［9，10］。
波浪线：per和tim的mRNA，黑线：抑制，双箭头线：可逆反应，红色箭头：降解，P：磷酸基团，蓝线：核膜，黑色X：降解的蛋白质。改编自Rosato等［2，7，10］
这些生物钟组件是通过组成两个“转录/翻译反馈环路”来产生昼夜节律的。这个环路的周期为24h，它包含两个部分，一部分是日间转录因子如CLK和CRY，它们的启动子包含V/P-b
oxes（TTATGTAA），它们的增强子受到VRI（Vrille）和PDP1ε（Par domain protein1ε）的抑制。另一部分是夜间转录因子包括per， tim，vri和pdp1ε，它们的序列中包含E-boxes（CACGTG），增强子序列被CLK-CYC附着［7］。
3.1 PER和TIM反馈环路
CLK和CYC是两个正向转录因子，它们可以增强序列含有E-box的基因的转录［7］。所以CLK-PER能驱动包括PER和TIM在内的夜间转录因子，它们在前半夜转移到细胞质中。per和tim的mRNA在ZT16时达到峰值，但PER和TIM蛋白高峰延迟约6小时［2］。这是由磷酸化引起的，PER蛋白被DBT和CK2磷酸化而变得不稳定，只有通过与TIM结合或由PP2A去除磷酸酶而恢复稳定［10］。TIM被SGG磷酸化后，PER、TIM、激酶和磷酸酶一起移入细胞核。 PER与CLK的PAS结构域相互作用并把DBT移到CLK旁使它磷酸化，从而把CLK-CYC从E-box上移走，并最终导致per和tim转录终止。最后pCLK和pPER因为被DBT磷酸化而降解［2］。同时，光通过蓝光感受器CRY（CRYPTOCHROME）促进TIM蛋白质的磷酸化、泛素化直至降解［11］。黎明前，PER的含量锐减，所以CLK-CYC复合物能在翌日重启整个环路［7］（图1）。
3.2 CLK反馈环路
CLK通过激活剂PDP1ε和抑制剂VRI的交互作用达到节律性转录。首先CLK-CYC能与PDP1ε和VRI的E-box结合使它们转录［7］。VRI-VRI同源二聚体会很快产生并且结合V/P boxes（TTATGTAA）序列，从而抑制CLK的转录。到了晚上PDP1ε同源二聚体形成，并与VRI竞争V/P box，从而重启clk的转录［7］。PER/TIM反馈环路和CLK反馈环路共同作用，保证了昼夜节律的稳定性［2］（图2）。
生物钟必须与昼夜周期同步，从而使生物体的新陈代谢、生理和行为在合适的时间发生。温度、食物和光都可以调控生物节律振荡器，其中光是最有效的调控因子［7］。在果蝇中，生物钟重设需要CRY、JET（Jetlag）和E3泛素连接酶。CRY包含一个光修复酶结构域和一个羧基末端结构域。羧基末端结构域可以在光的作用下产生的TIM结合区域与TIM或者TIM复合物结合，再结合酪氨酸激酶，使TIM降解［10］。
输出途径即时间信号调控生理和行为节律，该领域还未被深入研究。这些行为可能被基因直接控制，或者由磷酸酶和激酶间接调控［10］。
色素驱动因子（Pigment dispersing factor，PDF）蛋白被认为调控成年果蝇的运动节律（或称睡眠-觉醒节律）。它的作用原理有两种假说，一种认为PDF和其它神经肽抑制或激活运动环路和睡眠环路；另一种认为相关细胞含有一个外周生物钟，它能接受中枢生物钟的信号，同步行为［12］。
果蝇的生物钟细胞包括神经元细胞和非神经元细胞，它们存在于整个果蝇体内。这些生物钟细胞分别位于下丘脑中枢生物钟和位于其它器官的外周生物钟。中枢生物钟控制成年果蝇的运动节律，而外周生物钟涉及感受光和表达CRY［7］。
山夫
有你的快乐风与月在果蝇的下丘脑中有9簇中枢生物钟细胞，根据它们的解剖学定位和大小命名：4簇背神经元（DN1a，DN1p，DN2，DN3）；背外侧神经元（LNd）；腹外侧神经元（LNv），LNv按大小进一步分为l-LNv和s-LNv； 第五小外侧神经元（LNv5）和侧后方神经元（LPN）［12］。s-LNv在连续黑暗情况下控制运动节律，其它中枢生物钟细胞也调控运动节律，但是它们都是光依赖的。中枢生物钟细胞有发达的通信网络，这个网络依靠神经递质和膜兴奋传导。PDF是研究得比较深入的神经肽，它由LNv细胞簇在黎明释放，其它钟基因都被这个信号同步。s-LNvs表达CRY，它能从感光细胞那里接收光，并把信号传导到其它细胞［7］（图3）。
果蝇有几种行为显示昼夜节律。成年果蝇的运动节律（睡眠-觉醒节律）已被深入研究。在持续黑暗条件下，运动节律图在黄昏达到顶峰。电生理实验揭示了sLNvs对运动节律有很大影响。sLNvs向背脑细胞群发送PDF信号，然后生成自由运行的运动节律。在12：12光照黑暗条件下，运动节律显示出早晚两个高峰。已知LNVs驱动早高峰，而LNDs和DN1s的一部分控制晚高峰［10］。
另一种果蝇昼夜节律行为是羽化。羽化行为中持续光照和12：12光照黑暗条件的相位改变与运动节律不同。有两种假说可以解释，一个是羽化和成年果蝇运动节律由不同的生物钟基因控制；另一个是中枢和外周生物钟同时调控果蝇羽化。研究表明羽化不仅需要LN vs细胞和P DF蛋白，还需要其它物质。有可能是前胸腺（protothoracic gland，PG）产生的荷尔蒙信号［13］。
炒海带结从果蝇和其它动物身上研究出的昼夜节律生物钟分子机制，由于其保守性，为人们理解人类的昼夜节律奠定了基础。两个相互依赖的转录/翻译反馈环路假说，经历了时间的考验，但仍需要进一步完善，未来应加强对时间信号如何控制行为的研究。相信通过研究的不断深入，昼夜节律生物钟的神秘面纱将被进一步揭开。
【相关文献】
［1］Chang，D.C.，Neural circuits underlying circadian behavior in Drosophila melanogaster，Behavioural process，2006，71（2-3）：211-225.
［2］Rosato，E.& Kyriacou，C.P.，The role of natural lection in circadian behaviour：a molecular-genetic approach，Essays in biochemistry，2011，49（1）：71-85.
［3］王正荣.时间生物学［M］.科学出版社有限责任公司（第1版），2006.
［4］Disl S，Hann CN，zkaya，Hemsley M， Kyriacou CP，Rosato E. The logic of circadian organization in Drosophila.Curr Biol，2014，24（19）：2257-66.质量月
［5］Amita Sehgal，*t Jeffrey L. Price，t Bernice Man，t，Loss of circadian behavioral rhythms and per RNA oscillation， Science，1996，263（5153）：1603.
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