㊀Ｇｕｉｈａｉａ㊀Ｍａｒ.２０２０ꎬ４０(３):３３５－３４４
贫困申请书范文800字
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ＤＯＩ:１０.１１９３１/ｇｕｉｈａｉａ.ｇｘｚｗ２０１９０９０１８
李菲ꎬ黄庶识ꎬ胡文进ꎬ等.桐花树内生和根际细菌多样性及抗血栓活性研究[Ｊ].广西植物ꎬ２０２０ꎬ４０(３):３３５－３４４.
ＬＩＦꎬＨＵＡＮＧＳＳꎬＨＵＷＪꎬｅｔａｌ.Ｄｉｖｅｒｓｉｔｙａｎｄａｎｔｉ￣ｔｈｒｏｍｂｏｔｉｃａｃｔｉｖｉｔｙｏｆｅｎｄｏｐｈｙｔｉｃａｎｄｒｈｉｚｏｓｐｈｅｒｉｃｂａｃｔｅｒｉａｉｓｏｌａｔｅｄｆｒｏｍＡｅｇｉｃｅｒａｓｃｏｒｎｉ￣ｃｕｌａｔｕｍ[Ｊ].Ｇｕｉｈａｉａꎬ２０２０ꎬ４０(３):３３５－３４４.
桐花树内生和根际细菌多样性及抗血栓活性研究
李㊀菲１ꎬ黄庶识２ꎬ胡文进３ꎬ李㊀喆２ꎬ黄媛林２ꎬ王巧贞２ꎬ潘信利２∗
(１.广西科学院广西近海海洋环境科学重点实验室ꎬ南宁５３０００７ꎻ２.广西科学院广西海洋天然产物与组合生物
合成化学重点实验室ꎬ南宁５３０００７ꎻ３.广西科学院ꎬ国家非粮生物质能源工程技术研究中心ꎬ非粮生物质酶解国家重点实验室ꎬ广西生物炼制重点实验室ꎬ广西生物质工程技术研究中心ꎬ南宁５３０００７)摘㊀要：红树植物内生菌在红树共生体的物质循环㊁能量传递和健康维护等方面起着重要作用ꎮ为探究红树植物内生菌的多样性ꎬ进一步揭示内生菌在红树共生体的功能多样性提供菌种资源ꎬ该研究选择６种分离培养基和采用传统稀释涂布法对从广西北海滩涂上采集的桐花树组织和根际土壤样品进行分离ꎬ对获得的可培养细菌进行多样性分析ꎬ并通过体外溶栓实验筛选出具有抗血栓活性的菌株ꎮ结果表明:(１)基于１６ＳｒＲＮＡ基因序列系统进化分析ꎬ从桐花树组织和根际土壤中共获得１２５株细菌ꎻ分布于变形菌门(Ｐｒｏ￣ｔｅｏｂａｃｔｅｒｉａ)㊁放线菌门(Ａｃｔｉｎｏｂａｃｔｅｒｉａ)和厚壁菌门(Ｆｉｒｍｉｃｕｔｅｓ)３个门２７个科３９个属７４个种中ꎬ芽孢杆菌属为优势菌属ꎬ菌株数量占１３.５％ꎮ(２)抗血栓活性实验表明ꎬ初筛获得１８株具有抗血栓活性细菌ꎬ总阳性率为２４.３２％ꎻ将初筛有活性的菌株进行复筛和重复验证实验ꎬ进一步验证其活性ꎬ结果复筛出３株细
菌Ｂ１８５０㊁Ｂ１９８９和Ｂ２６３２具有很强抗血栓活性ꎮ综上所述ꎬ广西北海滩涂上红树植物桐花树中存在丰富的可培养细菌资源ꎬ具有从中挖掘新的纤溶酶和开发溶血栓药物的潜力ꎮ
关键词：桐花树ꎬ内生细菌ꎬ根际细菌ꎬ多样性ꎬ抗血栓活性
中图分类号:Ｑ９３９.１㊀㊀文献标识码:Ａ
文章编号:１０００￣３１４２(２０２０)０３￣０３３５￣１０开放科学(资源服务)标识码(ＯＳＩＤ):
Ｄｉｖｅｒｓｉｔｙａｎｄａｎｔｉ￣ｔｈｒｏｍｂｏｔｉｃａｃｔｉｖｉｔｙｏｆｅｎｄｏｐｈｙｔｉｃａｎｄｒｈｉｚｏｓｐｈｅｒｉｃｂａｃｔｅｒｉａｉｓｏｌａｔｅｄｆｒｏｍＡｅｇｉｃｅｒａｓｃｏｒｎｉｃｕｌａｔｕｍＬＩＦｅｉ１ꎬＨＵＡＮＧＳｈｕｓｈｉ２ꎬＨＵＷｅｎｊｉｎ３ꎬＬＩＺｈｅ２ꎬＨＵＡＮＧＹｕａｎｌｉｎ２ꎬ
ＷＡＮＧＱｉａｏｚｈｅｎ２ꎬＰＡＮＸｉｎｌｉ２∗
收稿日期:２０２０－０１－０３
野外玉石原石的鉴别
基金项目：国家自然科学基金(３１５６００１７)ꎻ广西自然科学基金重点项目(２０１４ＧＸＮＳＦＤＡ１１８０１２)ꎻ广西科技计划重点研发项目(桂科ＡＢ１６３８００７１)ꎻ广西科技计划科技基地和人才专项项目(桂科ＡＤ１７１２９０１９)ꎻ广西科学院基本业务费项目(２０１７ＹＪＪ２３０２０)ꎻ广西海洋天然产物与组合生物合成化学重点实验室运行费项目(１７￣２５９￣７４)[ＳｕｐｐｏｒｔｅｄｂｙｔｈｅＮａｔｉｏｎａｌＮａｔｕｒａｌＳｃｉｅｎｃｅＦｏｕｎｄａｔｉｏｎｏｆＣ
ｈｉｎａ(３１５６００１７)ꎻＫｅｙＰｒｏｇｒａｍｏｆＮａｔｉｏｎａｌＮａｔｕｒａｌＳｃｉｅｎｃｅＦｏｕｎｄａｔｉｏｎｏｆＧｕａｎｇｘｉ(２０１４ＧＸＮＳＦＤＡ１１８０１２)ꎻＫｅｙＲｅｓｅａｒｃｈａｎｄＤｅｖｅ￣ｌｏｐｍｅｎｔＰｒｏｇｒａｍｏｆＧｕａｎｇｘｉ(ＡＢ１６３８００７１)ꎻＳｐｅｃｉａｌＰｒｏｇｒａｍｆｏｒｔｈｅＢａｓｅｏｆＧｕａｎｇｘｉＳｃｉｅｎｃｅａｎｄＴｅｃｈｎｏｌｏｇｙａｎｄＴａｌｅｎｔｓ(ＡＤ１７１２９０１９)ꎻＦｕｎｄａｍｅｎｔａｌＲｅｓｅａｒｃｈＦｕｎｄｆｏｒＧｕａｎｇｘｉＡｃａｄｅｍｙｏｆＳｃｉｅｎｃｅｓ(２０１７ＹＪＪ２３０２０)ꎻＧｕａｎｇｘｉＫｅｙＬａｂｏｒａｔｏｒｙｏｆＭａｒｉｎｅＮａｔｕｒａｌＰｒｏｄｕｃｔｓａｎｄＣｏｍｂｉｎａｔｏｒｉａｌＢｉｏｓｙｎｔｈｅｓｉｓＣｈｅｍｉｓｔｒｙ(１７￣２５９￣７４)]ꎮ
作者简介：李菲(１９８８－)ꎬ女ꎬ广西南宁人ꎬ硕士ꎬ助理研究员ꎬ主要从事广西北部湾海洋微生物研究ꎬ(Ｅ￣ｍａｉｌ)ｆｉｎｙｌｅｅ＠ｙｅａｈ.ｎｅｔꎮ∗通信作者：潘信利ꎬ博士ꎬ助理研究员ꎬ主要从事海洋微生物资源开发与利用研究ꎬ(Ｅ￣ｍａｉｌ)ｐｘｌ＠ｇｘａｓ.ｃｎꎮ
(１.ＧｕａｎｇｘｉＫｅｙＬａｂｏｒａｔｏｒｙｏｆＭａｉｎｅＥｎｖｉｒｏｎｍｅｎｔａｌＳｃｉｅｎｃｅꎬＧｕａｎｇｘｉＡｃａｄｅｍｙｏｆＳｃｉｅｎｃｅｓꎬＮａｎｎｉｎｇ５３０００７ꎬＣｈｉｎａꎻ２.ＧｕａｎｇｘｉＫｅｙＬａｂｏｒａｔｏｒｙｏｆＭａｒｉｎｅＮａｔｕｒａｌＰｒｏｄｕｃｔｓａｎｄＣｏｍｂｉｎａｔｏｒｉａｌＢｉｏｓｙｎｅｔｈｅｓｉｓＣｈｅｍｉｓｔｒｙ
ꎬＧｕａｎｇｘｉＡｃａｄｅｍｙｏｆＳｃｉｅｎｃｅｓꎬＮａｎｎｉｎｇ５３０００７ꎬＣｈｉｎａꎻ３.ＮａｔｉｏｎａｌＥｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇＲｅｓｅａｒｃｈＣｅｎｔｅｒｆｏｒＮｏｎ￣ＦｏｏｄＢｉｏｒｅｆｉｎｅｒｙꎬＳｔａｔｅＫｅｙＬａｂｏｒａｔｏｒｙｏｆＮｏｎ￣ＦｏｏｄＢｉｏｍａｓｓａｎｄＥｎｚｙｍｅＴｅｃｈｎｏｌｏｇｙꎬＧｕａｎｇｘｉＫｅｙＬａｂｏｒａｔｏｒｙｏｆＢｉｏ￣ｒｅｆｉｎｅｒｙꎬＧｕａｎｇｘｉＢｉｏｍａｓｓＥｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇＴｅｃｈｎｏｌｏｇｙＲｅｓｅａｒｃｈＣｅｎｔｅｒꎬＧｕａｎｇｘｉＡｃａｄｅｍｙｏｆＳｃｉｅｎｃｅｓꎬＮａｎｎｉｎｇ５３０００７ꎬＣｈｉｎａ)
Ａｂｓｔｒａｃｔ:Ｍａｎｇｒｏｖｅｅｎｄｏｐｈｙｔｅｓｐｌａｙａｎｉｍｐｏｒｔａｎｔｒｏｌｅｉｎｔｈｅｍａｔｅｒｉａｌｃｙｃｌｅꎬｅｎｅｒｇｙｔｒａｎｓｆｅｒａｎｄｈｅａｌｔｈｍａｉｎｔｅｎａｎｃｅｏｆｍａｎｇｒｏｖｅｐｌａｎｔｓ.Ｉｎｏｒｄｅｒｔｏｅｎｒｉｃｈｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｉｃａｌｒｅｓｏｕｒｃｅｓｆｏｒｆｕｒｔｈｅｒｒｅｖｅａｌｉｎｇｔｈｅｆｕｎｃｔｉｏｎａｌｄｉｖｅｒｓｉｔｙｏｆｔｈｅｅｎｄｏ￣ｐｈｙｔｅｓｍｉｃｒｏｏｒｇａｎｉｓｍｉｎｍａｎｇｒｏｖｅｐｌａｎｔｓꎬｉｎｔｈｉｓｓｔｕｄｙꎬｗｅｉｎｖｅｓｔｉｇａｔｅｄｔｈｅｄｉｓｔｒｉｂｕｔｉｏｎａｎｄｄｉｖｅｒｓｉｔｙｏｆｅｎｄｏｐｈｙｔｉｃａｎｄｒｈｉｚｏｓｐｈｅｒｉｃｂａｃｔｅｒｉａｏｆＡｅｇｉｃｅｒａｓｃｏｒｎｉｃｕｌａｔｕｍｃｏｌｌｅｃｔｅｄｆｒｏｍＢｅｉｈａｉＣｉｔｙꎬａｎｄｓｔｕｄｉｅｄｔｈｅａｎｔｉ￣ｔｈｒｏ
觉察
ｍｂｏｔｉｃａｃｔｉｖｉｔｉｅｓｏｆｔｈｏｓｅｓｔｒａｉｎｓ.ＴｈｅｅｎｄｏｐｈｙｔｉｃａｎｄｒｈｉｚｏｓｐｈｅｒｉｃｂａｃｔｅｒｉａｗｅｒｅｉｓｏｌａｔｅｄｆｒｏｍＡ.ｃｏｒｎｉｃｕｌａｔｕｍｂｙｕｓｉｎｇｓｉｘｄｉｆｆｅｒｅｎｔｉｓｏｌａｔｉｏｎｍｅｄｉａ.Ｔｈｅａｎｔｉ￣ｔｈｒｏｍｂｏｔｉｃａｃｔｉｖｉｔｉｅｓｏｆａｌｌｓｐｅｃｉｅｓｗｅｒｅｓｃｒｅｅｎｅｄｏｕｔｂｙｔｈｒｏｍｂｏｌｙｓｉｓｅｘｐｅｒｉｍｅｎｔｉｎｖｉｔｒｏ.Ｔｈｅｒｅｓｕｌｔｓｗｅｒｅａｓｆｏｌｌｏｗｓ:(１)Ｂａｓｅｄｏｎｔｈｅｐｈｙｌｏｇｅｎｅｔｉｃａｎａｌｙｓｉｓｏｆ１６ＳｒＲＮＡｇｅｎｅｓｅｑｕｅｎｃｅꎬａｔｏｔａｌｏｆ１２５ｓｔｒａｉｎｓｗｅｒｅｏｂ￣ｔａｉｎｅｄｆｒｏｍｔｈｅｔｉｓｓｕｅａｎｄｒｈｉｚｏｓｐｈｅｒｅｓｏｉｌｏｆＡ.ｃｏｒｎｉｃｕｌａｔｕｍ.Ｔｈｅｙｗｅｒｅｃｌａｓｓｉｆｉｅｄｉｎｔｏ７４ｓｐｅｃｉｅｓꎬ３９ｇｅｎｅｒａꎬ２７ｆａｍｉ￣ｌｉｅｓａｎｄ３ｐｈｙｌａｓｏｆＰｒｏｔｅｏｂａｃｔｅｒｉａꎬＡｃｔｉｎｏｂａｃｔｅｒｉａａｎｄＦｉｒｍｉｃｕｔｅｓ.Ｂａｃｉｌｌｕｓｓｐ.ｗａｓｔｈｅｄｏｍｉｎａｎｔｇｅｎｕｓꎬａｎｄｔｈｅｔｏｔａｌｒａｔｅｗａｓ１３.５％.(２)Ｔｈｅｒｅｓｕｌｔｓｏｆａｎｔｉ￣ｔｈｒｏｍｂｏｔｉｃａｃｔｉｖｉｔｙｔｅｓｔｓｈｏｗｅｄｔｈａｔ１８ｓｔｒａｉｎｓｗｉｔｈａｎｔｉ￣ｔｈｒｏｍｂｏｔｉｃａｃｔｉｖｉｔｙｗｅｒｅｓｃｒｅｅｎｅｄｏｕｔꎬａｎｄｔｈｅｔｏｔａｌｐｏｓｉｔｉｖｅｒａｔｅｒｅａｃｈｅｄｔｏ２４.３２％.Ｔｈｅａｃｔｉｖｉｔｙｏｆｔｈｅｓｔｒａｉｎｓｗａｓｆｕｒｔｈｅｒｖｅｒｉｆｉｅｄｂｙｔｈｅｒｅ￣ｓｃｒｅｅｎｉｎｇａｎｄｒｅ￣ｖｅｒｉｆｉｃａｔｉｏｎｔｅｓｔ.Ｔ
ｈｅｓｔｒａｉｎｓｏｆＢ１８５０ꎬＢ１９８９ａｎｄＢ２６３２ｗｉｔｈｓｔｒｏｎｇａｎｔｉ￣ｔｈｒｏｍｂｏｔｉｃａｃｔｉｖｉｔｙｗｅｒｅｏｂ￣ｔａｉｎｅｄ.ＴｏｓｕｍｕｐꎬｔｈｅｒｅａｒｅａｂｕｎｄａｎｔｃｕｌｔｕｒａｂｌｅｂａｃｔｅｒｉａｌｒｅｓｏｕｒｃｅｓｉｎＡｅｇｉｃｅｒａｓｃｏｒｎｉｃｕｌａｔｕｍｉｎＢｅｉｈａｉｏｆＧｕａｎｇｘｉꎬｗｈｉｃｈｃｏｕｌｄｂｅａｐｏｔｅｎｔｉａｌｓｏｕｒｃｅｆｏｒｔｈｅｄｉｓｃｏｖｅｒｙｏｆｎｅｗｐｌａｓｍｉｎｏｇｅｎａｎｄｔｈｒｏｍｂｏｌｙｔｉｃｄｒｕｇｓ.
Ｋｅｙｗｏｒｄｓ:Ａｅｇｉｃｅｒａｓｃｏｒｎｉｃｕｌａｔｕｍꎬｅｎｄｏｐｈｙｔｉｃｂａｃｔｅｒｉａꎬｒｈｉｚｏｓｐｈｅｒｉｃｂａｃｔｅｒｉａꎬｄｉｖｅｒｓｉｔｙꎬａｎｔｉ￣ｔｈｒｏｍｂｏｔｉｃａｃｔｉｖｉｔｙ
㊀㊀血栓性疾病是一类严重威胁人类健康的常见病㊁多发病ꎬ常表现为心绞痛㊁心肌梗死㊁脑栓塞和脑梗死等ꎬ多以中老年人为主要发病群体ꎬ现发病人群逐渐趋于年轻化ꎬ且发病率与死亡率在不断上升(乔德水等ꎬ２００９ꎻＪäｒｅｍｏｅｔａｌ.ꎬ２０１３)ꎮ血栓性疾病的起因主要是血管腔中形成血栓使其变得狭窄或闭塞ꎬ导致主要器官缺血或梗死ꎮ而血栓是人体内血液组成成分在血管或心脏内形成的凝块ꎬ可脱落凝块随血液流至远端ꎬ从而堵塞血管腔(Ｓｕｎｅｔａｌ.ꎬ２００８)ꎮ目前临床上主要有三大类治疗血栓性疾病的药物ꎬ即抗血小板类㊁抗凝血类和溶血栓药物ꎮ传统的溶血栓药物在临床上虽具有确切的疗效和良好的安全性ꎬ但其存在的半衰期短㊁纤维蛋白特异性低和价格贵等缺点也不容忽
视(翁郁华等ꎬ２０１０)ꎮ因此ꎬ寻找能解决上述问题的溶血栓药物具有广泛的应用前景ꎮ
近年来ꎬ海洋微生物是新型纤溶酶的重要来源之一ꎮＬａｋｓｈｍｉｅｔａｌ.(２０１３)从海洋沙雷菌(Ｓｅｒ￣ｒａｔｉａｓｐ.ＲＳＰＢ１１)分离到一种具有纤维蛋白水解活性和高热稳定的碱性金属蛋白酶ꎮ李占强等(２００９)从南海沉积物中分离到的短小芽孢杆菌(ＢａｃｉｌｌｕｓｐｕｍｉｌｕｓＢ５８１５)ꎬ其纤溶酶活性好且产酶量高ꎮＨｕａｎｇｅｔａｌ.(２０１３)从海洋枯草芽孢杆菌(ＢａｃｉｌｌｕｓｓｕｂｔｉｌｉｓＨＡＳ￣３)分离到一种纤维蛋白水解酶ꎮ刘晨光等(２００１)分离到一株海洋假单胞菌(Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓｓｐ.)可产生较强的直接溶解纤维蛋白和具有抗血栓活性的碱性蛋白酶ＭＰＡＰꎮ这些为从海洋微生物来源寻找抗血栓的药物提供了很好的依据ꎮ桐花树系红树林中广布种之一ꎬ广泛分布于亚洲至大洋洲热带海岸ꎬ在我国的广东㊁广西㊁福建和海南等省(区)均有分布(缪绅裕等ꎬ２００７)ꎮ我国的桐花树由于受到常年全日潮水的浸淹ꎬ使之生长状况㊁营养发育㊁生物量分配㊁激素水平和相关酶系等方面的生理生态性质表现出梯度性反应(何斌源等ꎬ２００７)ꎬ其内生菌长期生活于植物体内的特殊环境中并与之协同进化ꎮ植物体为其提供生长所必需的能量和营养的同时ꎬ内生菌又会通过自身的代谢㊁信号传导对植物体产生响应(文才艺等ꎬ２００４)ꎮ本研究以广西北海滩涂的桐花树中分离㊁培养和鉴定出的植物内生和根际细菌为样本ꎬ旨在筛选出具有高效抗血栓活性的菌株ꎮ１㊀材料与方法
１.１材料
１.１.１样本来源㊀桐花树于２０１８年８月在广西北海滩涂(１０８ʎ５０ᶄ４２ᵡＥ㊁２１ʎ５５ᶄ２５ᵡＮ)采集ꎮ样品装于密封袋ꎬ４ħ低温保藏带回实验室ꎬ尽快完成
６３３广㊀西㊀植㊀物４０卷
前处理和分离工作ꎮ
门户网站建设１.１.２羊血实验试剂㊀无菌脱纤维羊血(初筛羊血)和抗凝羊血(复筛羊血)ꎬ均购买于南宁茂接微生物科技有限公司ꎮ
阳性对照药物：血塞通片(云南维和药业股份有限公司)ꎬ购买于一心药业ꎮ
１.１.３培养基㊀(１)分离培养基:ＡＧＧ㊁Ｍ５㊁Ｐ７㊁Ｍ１０㊁Ｍ４和Ｐ３ꎬ详情信息见表１ꎮ
表１㊀细菌分离培养基配方
Ｔａｂｌｅ１㊀Ｃｏｎｐｏｎｅｎｔｓｏｆｃｕｌｔｕｒｅｍｅｄｉａｆｏｒｂａｃｔｅｒｉａｌｉｓｏｌａｔｉｏｎ
分离培养基
Ｉｓｏｌａｔｅｄｃｕｌｔｕｒｅｍｅｄｉｕｍ㊀㊀㊀㊀主要成分
㊀㊀㊀㊀Ｍａｉｎｃｏｍｐｏｎｅｎｔ其他成分㊀㊀㊀㊀㊀㊀
Ｏｔｈｅｒｃｏｍｐｏｎｅｎｔｓ㊀㊀㊀㊀㊀㊀
ＡＧＧ可溶性淀粉１０.０ｇꎬ葡萄糖１.０ｇꎬ甘油１０ｍＬ
Ｓｏｌｕｂｌｅｓｔａｒｃｈ１０.０ｇꎬｇｌｕｃｏｓｅａｎｈｙｄｒｏｕｓ１.０ｇꎬｇｌｙｃｅｒｏｌ１０ｍＬ琼脂１４.０ｇ
Ａｇａｒ１４.０ｇ
去离子水１０００ｍＬ
Ｄｅｉｏｎｉｚｅｄ－ｗａｔｅｒ１０００ｍＬ
ｐＨ７.２~７.４复合盐母液１０ｍＬＣｏｍｐｏｕｎｄｉｏｎｃｏｎｃｅｎｔｒａｔｅ１０ｍＬ
Ｍ５海藻糖５.０ｇꎬ脯氨酸１.０ｇꎬ土壤浸出液２０ｍＬ
Ｔｒｅｈａｌｏｓｅ５.０ｇꎬｐｒｏｌｉｎｅ１.０ｇꎬｓｏｉｌｅｘｔｒａｃｔ２０ｍＬ
Ｐ７Ｌ－天门冬酰胺１.０ｇꎬ酪氨酸０.５ｇꎬ甘油１０ｍＬ
Ｌ－Ａｓｐａｒａｇｉｎｅ１.０ｇꎬｔｙｒｏｓｉｎｅ０.５ｇꎬｇｌｙｃｅｒｏｌ１０ｍＬ
Ｍ１０可溶性淀粉１０.０ｇꎬ水解酪素０.５ｇ
Ｓｏｌｕｂｌｅｓｔａｒｃｈ１０.０ｇꎬｈｙｄｒｏｌｙｚｅｄｃａｓｅｉｎ０.５ｇ
Ｍ４Ｌ－天门冬酰胺１.０ｇꎬ海藻糖５.０ｇꎬ甘油１０ｍＬ
Ｌ－Ａｓｐａｒａｇｉｎｅ１.０ｇꎬｔｒｅｈａｌｏｓｅ５.０ｇꎬｇｌｙｃｅｒｏｌ１０ｍＬ找一找
Ｐ３粗燕麦粉２０.０ｇ
观赏鱼饲养Ｃｒｕｄｅｏａｔ２０.０ｇ
㊀注：复合盐母液㊀㊀ＫＮＯ３１.０ｇꎬＫ２ＨＰＯ４０.５ｇꎬＭｇＳＯ４ ７Ｈ２Ｏ０.５ｇꎬＮａＣｌ０.５ｇꎬＮＨ４ＮＯ３０.１ｇꎬＦｅＳＯ４０.０１ｇꎬＺｎＳＯ４ ７Ｈ２Ｏ０.００１ｇꎬＭｎＣｌ２ Ｈ２Ｏ０.００１ｇꎬ去离子水１０ｍＬꎮ
㊀Ｎｏｔｅ:Ｃｏｍｐｏｕｎｄｉｏｎｃｏｎｃｅｎｔｒａｔｅ㊀㊀ＫＮＯ３１.０ｇꎬＫ２ＨＰＯ４０.
５ｇꎬＭｇＳＯ４ ７Ｈ２Ｏ０.５ｇꎬＮａＣｌ０.５ｇꎬＮＨ４ＮＯ３０.１ｇꎬＦｅＳＯ４０.０１ｇꎬＺｎＳＯ４ ７Ｈ２Ｏ０.００１ｇꎬＭｎＣｌ２ Ｈ２Ｏ０.００１ｇꎬｄｅｉｏｎｉｚｅｄ￣ｗａｔｅｒ１０ｍＬ.
㊀㊀(２)纯化培养基(改良ＩＳＰ２)：麦芽提取物２.０ｇꎬ葡萄糖２.０ｇꎬ酵母提取物２.０ｇꎬ琼脂１５.０ｇꎬ去离子水１０００ｍＬꎮ
(３)发酵培养基：改良ＩＳＰ２液体培养基ꎮ１.２菌株的分离纯化
１.２.１样品预处理㊀参照李菲等(２０１８)预处理方法ꎬ代表性地选择桐花树各组织进行细菌的分离实验ꎮ首先ꎬ用５％次氯酸钠溶液浸泡３~５ｍｉｎꎬ用无菌水冲洗多次ꎻ其次ꎬ用０.２％吐温２０溶液浸泡１０ｍｉｎꎬ用无菌水冲洗多次ꎻ最后ꎬ用７５％的酒精溶液浸泡５ｍｉｎꎬ用无菌水冲洗多次ꎮ消毒后的组织样品ꎬ分别用无菌手术刀进行切碎ꎻ取约１ｇ的样品进行充分研磨ꎬ加入９ｍＬ无菌水与样品混匀ꎬ即为初始的组织悬液ꎬ再依次稀释到１０￣３和１０￣４的组织悬液ꎬ待用ꎮ
桐花树根际样品的收集ꎬ轻轻刮下根须表面附着的土壤ꎬ平铺于无菌平皿中ꎬ经６５ħ热风干燥３０ｍｉｎꎮ称取２.０ｇ样品装于２０ｍＬ无菌水中摇匀ꎻ制成１０￣２和１０￣３稀释度的样液ꎬ待涂布处理ꎮ１.２.２细菌的分离纯化㊀取２００μＬ梯度稀释的样液接种于６种复合营养培养基中ꎬ２８ħ培养数周ꎬ并及时观察菌株的生长情况ꎬ挑取肉眼可见菌落进行纯化培养ꎬ记录其形态特征和相同菌落数ꎬ
以
３０％(Ｖ/Ｖ)甘油￣ＩＳＰ２混合液作为保护剂ꎬ将纯化好的菌株制成冻存管保藏于－７０ħꎮ
１.３１６ＳｒＲＮＡ系统发育分析
采用Ｃｈｅｌｅｘ￣１００树脂(周双清等ꎬ２０１０)快速提取细菌的ＤＮＡ作为ＰＣＲ模板ꎬ并根据Ｗａｌｓｈ(１９９１)的方法对其进行ＰＣＲ扩增ꎮ引物为２７Ｆ和１５２２Ｒꎬ参照李菲等(２０１８)的方法设定ＰＣＲ反应条件ꎮ扩增产物经１％琼脂糖￣ＴＡＥ凝胶电泳检测合格后ꎬ委托北京擎科新业生物技术有限公司进行测序分析ꎮ序列经ＢｉｏＥｄｉｔＳｅｑｕｅｎｃｅＡｌｉｇｎｍｅｎｔＥｄｉｔｏｒ软件整理后ꎬ利用ＥｚＴａｘｏｎ服务器进行在线比对(Ｋｉｍｅｔａｌ.ꎬ２００９)ꎻ以同源性最高菌株的有效序列作为参比对象ꎬ构建Ｎｅｉｇｈｂｏｒ￣Ｊｏｉｎｉｎｇ系统发育树ꎬ各分支置信值检测设为Ｂｏｏｓｔｒａｐ１０００次ꎬ对各菌株的系统发育地位进行分析(Ｌｉｅｔａｌ.ꎬ２０１７)ꎮ１.４细菌对抗血栓活性的筛选
１.４.１羊血培养基制备㊀以改良ＩＳＰ２固体培养基为基础培养基ꎬ１２１ħ高温蒸汽灭菌２０ｍｉｎꎮ待培养基冷却至５５ħꎬ添加１０％脱纤维无菌羊血ꎬ摇匀后
７３３
３期李菲等：桐花树内生和根际细菌多样性及抗血栓活性研究
倒入无菌平皿中ꎬ待平皿静置冷却２ｈ后ꎬ待用ꎮ１.４.２初筛㊀首先将排重后的７４株细菌ꎬ分别接种至ＩＳＰ２固体培养基上ꎬ取生长对数后期的细菌划线至羊血培养基上ꎬ每板划４株细菌ꎬ置于２８ħ的恒温培养箱培养ꎮ然后于２４ｈ后观察平板上微生物的生长情况ꎬ观察是否有透明圈ꎬ颜色变化等ꎮ再将产生明显透明圈的菌落划线至ＩＳＰ２固体培养基上ꎬ供复筛用ꎮ
１.４.３复筛㊀参考辛宏等(２０１８)的方法制备人工血栓ꎬ取３００μＬ脱纤维无菌羊血ꎬ至于灭菌西林瓶底部ꎬ加入９μＬ１ｍｏｌ Ｌ￣１的ＣａＣｌ３溶液ꎬ放置１０ｍｉｎꎬ待血液凝固使用ꎮ
将初筛结果良好的１６株细菌ꎬ分别接种于５０ｍＬ改良的ＩＳＰ２液体培养基上ꎬ２８ħꎬ１８０ｒ ｍｉｎ￣１摇床培养７ｄꎻ取出发酵液ꎬ８０００ｒ ｍｉｎ￣１离心１０ｍｉｎꎬ收集上清液ꎬ用０.２２μｍ微孔滤膜除菌ꎬ获得抗血栓活性待测液ꎻ取２ｍＬ待测液沿壁缓慢加入凝固的人工血栓中ꎬ以２ｍＬＩＳＰ２液体培养基和２ｍＬ０.７％生理盐水作阴性对照ꎬ以２ｍＬ０.１７３ｇ ｍＬ￣１血塞通片(含三七总皂苷含量为１００ｍｇ)为阳性对照ꎮ放入２８ħ培养ꎬ每隔２４ｈ观察一次血凝块溶解情况ꎬ并轻微晃荡ꎬ记录结果ꎮ
２㊀结果与分析
２.１桐花树中内生及根际细菌多样性分析
根据菌落的形态㊁颜色和大小等特征进行排重ꎬ选取１２５株细菌进行测序对比分析ꎬ获得７４种细菌ꎬ其中桐花树各组织中获得３４种内生细菌ꎬ隶属于１８科２２属ꎻ根际细菌４４种ꎬ隶属于２０科２７属ꎮ分别对桐花树的内生细菌和根际细菌构建Ｎ￣Ｊ系统进化树(图１和图２)ꎮ
２.２不同培养基对内生和根际细菌的分离效果采用６种培养基ꎬ从桐花树中分别获得内生和根际细菌７１株和６４株ꎻ经形态法和１６ＳｒＲＮＡ基因序列对比排重后ꎬ获得７４株细菌在６种培养基上分离效果(图３)ꎮ根据其分离效果分析:Ｐ３和Ｐ７培养基分离到细菌种类最多ꎬ均有１７个菌属ꎻＡＧＧ培养基分离的细菌种类最少ꎬ包含４个菌属ꎬ究其原因可能是ＡＧＧ培养基主要成分为淀粉ꎬ较适合优势放线菌群(链霉菌属)ꎮ由菌落数统计结果可知ꎬＭ１０㊁Ｍ５㊁ＡＧＧ㊁Ｍ４㊁Ｐ７和Ｐ３培养基上菌落数分别为４.３㊁３.１㊁１.２㊁７.３和７.２(ˑ１０５ｃｆｕ ｍＬ￣１)ꎮＰ３和Ｐ７培养基分离效果相近ꎬ获得的细菌均隶属于１７属ꎬ其菌种数和多样性均较高ꎻ而ＡＧＧ培养基获得的细菌均隶属于５属ꎬ故其获得较少的细菌数和多样性ꎮ
２.３内生及根际细菌的属级水平上的韦恩图分析在属级水平上对桐花树各组织和其根际来源细菌进行ｖｅｎｎ分析ꎬ结果显示ꎬ从桐花树各组织和根际中获得细菌种类存在较大的差异ꎬ桐花树内生细菌和根际细菌共有１０个相同的菌属ꎬ分别为Ｎｏｖｏｓｐｈｉｎｇｏｂｉｕｍｓｐ.㊁Ｓｐｈｉｎｇｏｍｏｎａｓｓｐ.㊁Ｇｏｒｄｏｎｉａｓｐ.㊁Ｍｉ￣ｃｒｏｃｏｃｃｕｓｓｐ.㊁Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓｓｐ.㊁Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓｓｐ.㊁Ｍｙｃｏｌｉｃｉ￣ｂａｃｔｅｒｉｕｍｓｐ.㊁Ｍｙｃ
ｏｂａｃｔｅｒｉｕｍｓｐ.㊁Ｂａｃｉｌｌｕｓｓｐ.和Ｍｉｃｒｏｂａｃ￣ｔｅｒｉｕｍｓｐ.ꎮ对桐花树各组织与根际来源的细菌分别进行ｖｅｎｎ分析ꎬ仅有一个共同的芽孢杆菌属(图４:Ａ)ꎻ根部分离的细菌与根际细菌有８个共同菌属(图４:Ｂ)ꎬ其他各组织分离的细菌与根际细菌的种属相差较大ꎮ
２.４细菌抗血栓活性初筛
将初筛的羊血平板放置２８ħ培养２４ｈ后ꎬ观察细菌生长和晕圈情况ꎮ结果显示ꎬ筛选７４种细菌的抗血栓活性ꎬ有１８种细菌显示出良好的抗血栓活性ꎬ总阳性为２４.３２％ꎻ分别隶属于Ｂａｃｉｌｌｕｓｓｐ.㊁Ｃｕｒｔｏｂａｃｔｅｒｉｕｍｓｐ.㊁Ｄｅｍｅｑｕｉｎａｓｐ.㊁Ｋｉｎｅｏｃｏｃｃｕｓｓｐ.㊁Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓｓｐ.和Ｓｐｈｉｎｇｏｍｏｎａｓｓｐ.ꎮ图５显示ꎬＢ２０６１㊁Ｂ２６３５和Ｂ１８２０显示无晕圈ꎬ即判定为无溶血活性ꎻＢ１５０２㊁Ｂ１５００和Ｂ１８５０显示出深色晕圈ꎬＢ１９８９㊁Ｂ２６３４和Ｂ２６３２表现为透明圈ꎬ两者均判定为具有溶血活性ꎮ
２.５细菌上清液对体外血栓的影响
根据上述抗血栓活性初筛结果ꎬ对１８株有活性菌株进行抗血栓活性复筛ꎮ图６结果显示ꎬ２４ｈ后ꎬＢ１８５０㊁Ｂ１９８９和Ｂ２６３２的上清发酵液将凝血块全部溶解ꎮ其余细菌的上清液与血凝块均有明显分层ꎬ凝血块较空白对照组的均有变小ꎬ上层溶液呈现出红色ꎬ故展示出微弱的溶血活性ꎬＩＳＰ２培养基和生理盐水空白组中凝血块均维持原样ꎬ下层为凝血块ꎬ固液分界线清晰ꎮ
３㊀讨论与结论
红树植物是生长在热带和亚热带潮间带河口地带的耐盐植物ꎬ分布在３０ʎＳ与３０ʎＮ之间ꎮ面对高度盐渍化㊁土壤缺氧㊁高光辐射㊁高矿物组成㊁
８３３广㊀西㊀植㊀物４０卷
图１㊀桐花树内生细菌的１６ＳｒＲＮＡ基因序列Ｎ￣Ｊ系统发育树
中国地理概况
国家职业技能鉴定Ｆｉｇ.１㊀Ｎ￣Ｊｐｈｙｌｏｇｅｎｅｔｉｃｔｒｅｅｏｆ１６ＳｒＲＮＡｇｅｎｅｓｅｑｕｅｎｃｅｓｏｆｅｎｄｏｐｈｙｔｉｃｂａｃｔｅｒｉａｉｎＡｅｇｉｃｅｒａｓｃｏｒｎｉｃｕｌａｔｕｍ９３３
３期李菲等：桐花树内生和根际细菌多样性及抗血栓活性研究
