摘要
乳铁蛋白是转铁蛋白家族的一员，一种可以结合铁的糖蛋白，分子量在80kDa左右，是近期研究较热门的蛋白之一。乳铁蛋白分子由一条肽链进行了折叠后形成两个对称的叶（N叶和C叶），两叶上都有铁结合位点。缺铁的乳铁蛋白和铁饱和的乳铁蛋白之间的构型有变化，可以相互转换。乳中的乳铁蛋白在脱脂和去酪蛋白后，可以用色谱、超滤、盐析等方法分离纯化，电泳法、HPLC、ELISA 等方法可以用来检测乳铁蛋白的含量。
关键词：乳铁蛋白铁结合折叠纯化检测
Abstract
Lactoferrin is an80kDa iron-binding glycoprotein of the transferrin protein family.It is a simple polypeptide chain folded into two symmetrical lobes(N and C lobes)。Each lobe can bind a iron atom.The conformations of LF vary depending on whether it is binding Fe3+.LF from the milk can be parated and purified by chromatography,ultrafiltration or salting after degreasing and remove the cain.The concentration of LF can be measured by electrophoresis,HPLC,ELISA and so on.
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Key Words:lactoferrin iron-binding fold purification measurement
凉拌黄瓜的调料配方乳铁蛋白（Lactoferrin ，LF ）是近期研究比较热门的蛋白，具有转运铁的功能，能够促进人体铁的蛋白。
一．乳铁蛋白的来源
乳铁蛋白于20世纪30年代，在牛奶中被发现，被称为红蛋白。乳铁蛋白是铁传递蛋白（transferrin ）家族中的一员，是具有结合铁功能的糖蛋白。转铁蛋白还包括血清转铁蛋白（rum transferrin ）、卵转铁蛋白（ovotransferrin ）、黑素转铁蛋白（melanotransferrin ）和碳酸酐酶抑制剂（the inhibitor of carbonic anhydra ）[1]。
这种糖蛋白还在粘膜分泌物中发现，如眼泪、唾液、阴道分泌物、精液、鼻和支气管分泌物、胆汁、胃和肠分泌物、尿液，其中常乳和初乳中的含量最高[2]。牛奶中的乳铁蛋白是由腺上皮细胞合成的。人乳和牛乳中乳铁蛋白含量随着哺乳期的延长而减少，但牛乳在非哺乳期LF 保持较高的含量[3]。奶酪乳清中的乳铁蛋白浓度大约是100mg/L 。
表1人乳和牛乳中LF 的含量[3]
二．理化性质
乳铁蛋白的分子量800kDa 左右，内含（铁结合部位），铁半饱和到饱和的乳铁蛋白成红色，在475n
m 处有特殊的吸收峰。
（一）铁结合
乳铁蛋白结合Fe 3+是可逆的，根据结合Fe 3+的多寡，可将乳铁蛋白分为缺铁型乳铁蛋白（apo-LF ）、铁半饱和型和铁饱和型（holo-LF ）。抗巴氏杀菌变性能力依次为：holo-LF>铁半饱和型>apo-LF 。天然状态的乳铁蛋白是部分饱和的。乳铁蛋白结合Fe 3+的能力依赖于CO 32-或者HCO 3-，而与柠檬酸盐的浓度呈负关系[4]。
（二）等电点
乳铁蛋白是碱性蛋白，表面具有多个带正电碱性区域。牛乳中的乳铁蛋白的等电点为pH8.0±0.2，人乳铁蛋白的pI 是5.6-6.1[4]。
（三）热稳定性
中国的朝代乳铁蛋白在碱性条件和中性条件下，容易失活。牛乳铁蛋白在pH 6.6的条件下，65～69℃时就发生失活。酸性条件下脱铁L F （apo-LF ）非常稳定，pH 4.0、90℃处理5min ，其铁结合能力、抗原活性以及抗菌活性与未处理前相同；在65～95初乳
常乳人乳
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6~14mg/ml 1.0~3.2mg/ml 牛乳1~5mg/ml 0.02~0.35mg/ml
℃的范围内，LF的热变性程度随温度升高而逐渐增加。另外人们发现，LF的热稳定性随铁饱和度的增加而增加，而且含铁LF的两叶（lobes）也具有不同的热稳定性。这可能是由于含铁LF的结构更紧密因而更难以失活。此外，脱铁LF在pH2.0～3.0，100～200℃处理5min时明显发生降解，而其抗菌活性却有所增强。这表明降解以后的小分子仍具有抗菌活性，LF的活性部位是很稳定的，能耐受酸性降解[5]。
牛乳铁蛋白的热稳定性取决于环境因素，如pH、盐和乳清蛋白。牛奶中的apo-bLF和holo-bLF比在磷酸缓冲液中对热更敏感。而在磷酸缓冲液中，apo-bLF 比holo-bLF变性得更快[6]。
图1：乳铁蛋白的分子结构
舔小豆豆三．分子结构
（一）氨基酸序列
现在确定的乳铁蛋白氨基酸序列，包括了从人、鼠、牛、马、猪、山羊、绵羊、水牛和骆驼中得出的数据。一个乳铁蛋白分子含有大约690个氨基酸残基[7]，这9个生物体的乳铁蛋白具有高度的同源性，其中有两个显著的共同特征：（1）内部序列的两倍重叠；（2）高pH的碱性特征[8]。
（二）分子结构
我和娘
乳铁蛋白分子立体结构主要呈“二枚银杏叶型”，由一条简易的多肽链折叠成两个对称的叶（N叶和C叶）形成，两叶都成环状结构，由一条部分α螺旋的铰链连接。人LF中，α螺旋区（铰链）由第333-343氨基酸残基组成，N叶是第1-332的氨基酸残基，C端是344-703氨基酸残基[9]。
LF多肽链由α螺旋和β折叠构成，N叶和C叶都折叠成相似的结构，大约有40%的相似性，不同之处在于环状叶结构。每叶都有2个相似的α/β结构域（N 叶：N1和N2；C叶：C1和C2），其中一叶基于6束β层状结构，另一叶基于5束β层状结构。每个结构域能够协同一个CO
2-，结合一个金属离子。结合的金
3
属离子主要是Fe2+和Fe3+，但发现Cu2+、Zn2+和Mn2+也可以结合[2]。结构域中的铁结合位点是一个深深的裂缝。目前X衍射的最大分辨率（2.8A）尚不能分辨此2个铁位点的不同[10]。
乳铁蛋白的一级结构中的半胱氨酸（Cys）的数量和位置决定着分子内二硫键的形成，而N端和C端的天门酰胺则是几个潜在的N-糖基化位点。分子中非共价的链接，大多数是疏水的，给两叶提供了一个缓冲部位，而C末端的螺旋（第678-691氨基酸残基，hLF）可以相互的作用。螺旋的N末端对着域间的裂缝，使得裂缝处带正电荷，另一个螺旋，N2（或C2）是CO
2-的结合部位[11]。
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图2乳铁蛋白的多肽链折叠[7]
a.铁饱和乳铁蛋白（holo-LF）。N叶在左边，C叶在右边（即多肽链的C末端和N末端）。标识着N1、N2、C1、C2的结构域（N1、C1黄色，N2、C2绿色）。连接两叶的螺旋结构H和C端螺旋显示为蓝色。两个铁结合部位为红色。
b.脱铁乳铁蛋白（apo-LF），两个晶体结构之一。N叶（左边）是开放的，在铁结合位点后有一个54°旋转的铰链。，而C叶是关闭的，即使在没有铁结合的状态下。另一种脱铁乳铁蛋白的晶体结构被发现，N叶和C叶同时关闭或开放。
这两个个状态之间的转变，正是转运铁的过程。
（三）乳铁蛋白的铁结合
乳铁蛋白结合Fe3+是可逆的，根据Fe3+的存在，可以分为脱铁LF（apo-LF）和铁饱和LF（holo-LF），并且这个不同状态的乳铁蛋白有不同的三维结构。apo-LF有一个开放的构型，而holo-LF有一个关闭的分子结构，并可以避免水解[12]。
1.铁结合和关闭的holo-lF结构[7]
铁结合到乳铁蛋白上后，N叶和C叶的两个结构域都关闭，与铁螯合。四个蛋白配体，再加上结合的CO
2-，共价结合金属离子，每个金属离子都交联N
3
