神经生物学实验讲义（七年制）
辣根过氧化物酶神经束路示踪技术
1971年首次报道辣根过氧化物酶（Horradish Peroxidea HRP）可被神经末梢摄取，经轴质流逆行运输到神经胞体，然后用组织化学方法即可显示神经元的轮廓，从而创建了HRP示踪技术。HRP示踪技术的基础是轴突运输，轴突运输是神经元的一项基本活动，即沿胞体到轴突末梢（顺向）及从轴突末梢向胞体（逆向）的物质转运。不同的物质转运有不同的运输速度，一般的速度为350mm/24小时。该法为研究神经元之间的联系提供了一种简便可行的方法。
HRP实验的基本步骤包括：动物麻醉、HRP注入、动物存活、灌注取材、切片、组织化学染色。
神经示踪常用药品准备
6%水合氯醛；4%多聚甲醛；0.9%生理盐水；20%蔗糖；戊二醛；0.1M磷酸缓冲液（0.1M PB）；60%游离HRP上班女郎
实验步骤
一、 （第一天12/20）舌肌注射
麻醉：6%水合氯醛腹腔注射：0.6ml/100g
60%游离辣根过氧化物酶：3mg加5ul生理盐水/鼠，配好液5ul/鼠
微量注射器(5ul)： 舌肌注射5ul辣根过氧化物酶，慢速1 ul/min, 留针5 min，大鼠存活24小时
二、 （第二天12/21）灌注取材
液体配制：生理盐水：500ml （灌注前温育到37℃)
固定液：4%多聚甲醛 200ml
戊二醛 7 ml 混匀（4℃保存使用）
20%蔗糖：0.1M 磷酸缓冲液（PB）（pH7.2）100 ml 混匀
蔗糖 20g （4℃保存）
灌注：大鼠腹腔注射6%水合氯醛2ml 特产英语麻醉，固定于取材台上，剪开皮肤暴露腹腔、剪开膈肌开胸充分暴露心脏，打开恒流泵，剪开心尖部插入灌流针至主动脉，剪开心耳，先灌注37℃生理盐水至组织器官变白（可以用较高的速度灌注），灌注量200ml。 再灌注4%多聚甲醛（低速灌注）灌注期间可见大鼠四肢、尾部有痉挛现象, 灌注量200ml。灌注至四肢及躯体僵硬。
取材：取脑（带延髓和颈髓）。
后固定：置于4%傅友德多聚甲醛中2小时，然后放在20%蔗糖中过夜。
三、（第三天12/22）切片染色
1、利用冰冻切片机，将脑组织切成40um厚度隔靴挠痒
2、0.2M PB配制：Na2HPO4•向谁学习12H2O 2.58g 加入1000ml蒸馏
NaH2PO4•2H2石头剪子布O 30.1g 水（D.W.）混合
丙烷的沸点4、四甲基联苯胺钨酸钠法（HRP易被分解退色，钨酸钠具有稳定作用）
反应液配制
A: 钨酸钠 1g
蒸馏水 47ml 不溶过滤 搅拌均匀
0.2M PB（pH5.0-5.4） 50 ml
B: TMB (四甲基联苯胺) 7mg
丙酮 1ml 振荡溶解
无水乙醇 1ml
C: 1N HCL 1ml
将A、B、C溶液混合制备反应液，备用。
成色过程
1、切片入D.W.牛油果沙拉中洗2-3次
2、在反应液中预浸20分钟（15℃-20℃）避光
3、避光湿育1小时（15℃-20℃），其间每十分钟加入0.3% H2O2 0.7ml直至温预结束（共加0.3% H2O2 六次）
4、0.2 M PB 1：4稀释（pH 5.0-5.4）洗3-6次，每次2-3分钟
5、在载玻片上裱片，干燥后经酒精脱水、二甲苯透明、封片。
