大悲山胚胎植入的研究进展：从基础到临床
摘要
胚胎植入是生殖医学领域的一个重要研究方向。胚胎植入的成功与否决定了妊娠结局甚至子代健康。文章总结了以小鼠为模式动物获得的研究成果及相关的临床研究进展，以期为提高临床辅助生殖技术妊娠率及降低孕早期流产率提供参考和指导。
关键词：胚胎植入；子宫接受态；早期胚胎丢失
新生命孕育起始于精卵结合形成受精卵即合子。在包括人类在内的哺乳动物中，合子经过几轮有丝分裂发育形成囊胚，而后必须植入子宫内膜才能继续进行体内发育。1978年世界第1例试管婴儿Loui Brown的出生是生殖基础研究应用于临床实践的里程碑，标志着人类辅助生殖技术的成功建立。经过近40年的发展，虽已有很大的进步，但辅助生殖临床实践中平均的胚胎植入率仅有40%～50%，远低于其他哺乳类动物（啮齿类动物为95%，兔为96%）。评价移植胚胎的质量对于提高辅助生殖技术成功率以及生出健康后代至关重要，而选择合适的子宫内膜接受态窗口期进行胚胎移植也同等重要。限于伦理约束，我们无法直接进行人类胚胎植入的在体机制研究。鉴于此，基因修饰模式动物成为了研究生殖相关事件的重要工具，提供了诸多有重要借鉴意义的线索。本文以小鼠研究为主，结合临床的相关研究阐述近年来在围植入期生物学事件的研究中取得的进展，以期为揭示人类胚胎植入的奥秘提供参考。
怎样打好乒乓球胚胎植入的概念
胚胎与母体子宫第1次亲密接触和对话，进而建立起直接生理联系的过程称为胚胎植入。胚胎的成功植入需要具有植入能力的囊胚和处于接受态的子宫同步发生，两者不可或缺。广义的胚胎植入包括了囊胚发育并获得植入能力、子宫进入接受态、囊胚-子宫相互作用完成植入过程、子宫基质细胞蜕膜化和胎盘发生等一系列生物学事件。狭义的胚胎植入是指囊胚获得植入能力、子宫成功建立接受态，以及两者同步互作完成植入的过程。本文仅对狭义的胚胎植入相关内容进行介绍。
胚胎发育并获得植入能力
精卵相遇后，精子头部进入成熟的卵母细胞，雄原核和雌原核融合，所产生的二倍体细胞称为受精卵。受精卵利用卵母细胞储备的RNA和蛋白质来推动其初始发育，直到胚胎基因组激活（embryonic genome activation，EGA）。EGA的时间具有物种特异性，小鼠的EGA转录活性在2细胞胚胎的晚期出现高峰，而人的EGA发生在4～8细胞胚胎阶段。研究报道，通过核苷酸微阵列分析技术获得小鼠全基因表达谱，明晰了几乎涵盖小鼠所有基因表达情况的植入前胚胎发育过程的动态网络图［1］，而通过单细胞RNA测序技术也全面解析了人早期胚胎各个时期的基因表达信息［2］，为揭示人类早期胚胎发育过程中的基因表达调控机制提供了宝贵的参考。体外培养和体内追踪胚胎发育的研究证实，小鼠胚胎植入后表胚层发育不依赖细胞凋亡机制，而是依赖于胞外基质的自我有序组织的特性建立细
胞极性，细胞顶端收缩进而形成腔体［3］。更有研究报道，可以将人类囊胚进行体外培养发育至植入后阶段，并证实了其具有自我组织的性质，说明胚胎早期发育与重塑事件主要取决于胚胎自身［4］。
法布尔的名言胚胎染色体异常是妊娠早期胚胎丢失的最常见原因。通过观察各个时期胚胎的细胞数量、大小均一性以及细胞碎片比例等形态学指标来评价胚胎质量，从而为临床胚胎移植选择提供依据。胚胎的发育潜能一定程度上也取决于配子的质量与成熟程度，然而目前尚无法实现通过对配子与胚胎的形态学评级来判断遗传物质的正确性，只能通过胚胎植入前遗传学诊断与筛查（preimplantation genetic diagnosis/screening，PGD/PGS）技术对携带染色体异常和部分基因病的胚胎进行排除。鉴于活检对胚胎有创伤，采用针对胚胎培养液成分的无创性检测可能是未来发展的方向。染色体嵌合型胚胎是另外一种异常的情况，既往认为此类胚胎受孕会存在孕期流产以及出生缺陷的风险，然而近期的研究报道移植此类胚胎也能获得健康活产婴儿［5］。因此，染色体嵌合型胚胎是否影响妊娠结局尚未定论。线粒体遗传病是一种特殊的母系遗传疾病。最新的研究报道，世界首例将线粒体疾病患者的卵母细胞纺锤体移植至正常女性去核的卵母细胞中，正常受精后成功妊娠，胎儿出生后遗传自母亲的线粒体遗传病发病的概率将大大降低［6］。这项研究突破了伦理限制，为严格意义上的“胚胎定制”开辟了新思路。随着近年来CRISPR/Cas9基因组编辑技术的发展，有望实现对人类胚胎遗传物质进行有效和精准的操纵，但仍有许多困难需要克服。
植入前胚胎发育成优势囊胚，这一过程中建立了两个不同的细胞群：内细胞团（inner cell mass，ICM）和滋养外胚层（trophectoderm，TE），两者分别发育为胚胎和胎盘。囊胚必须获得植入能力才能起始植入反应，该过程称为囊胚激活。小鼠妊娠第4天上午8～10点会出现一个雌激素分泌峰，在此之前将卵巢摘除可阻止胚胎植入，引发囊胚在子宫腔内休眠；持续注射孕酮可以维持囊胚的休眠状态，而重新注射雌激素则能激活囊胚并起始植入反应。囊胚延迟植入模型可作为一个强大的工具，在细胞增殖、翻译、代谢等多个层面揭示囊胚激活与休眠的相关机制［7］。近期研究报道，特异性敲除转录因子Myc或者抑制哺乳动物雷帕霉素靶蛋白（mammalian target of rapamycin，mTOR）导致体外培养的小鼠胚胎干细胞（embryonic stem cell，ES）停止增殖，类似于小鼠体内的胚胎休眠，恢复表达或者解除抑制后，干细胞可以继续增殖，且全能性未受影响［8-9］。然而到目前为止，尚未发现人类囊胚存在体内休眠的现象，有关人类囊胚的激活机制还有待进一步研究。
子宫接受态是一个动态的多因素网络化调控过程
劝告拼音激活后的囊胚必须与处于接受态的子宫互作，从而完成胚胎植入过程。
人不过如此与胚胎发育同步进行的是子宫上皮和基质细胞相继发生增殖和分化，促使子宫进入一个短暂的接受胚胎植入的阶段，即接受态，也称为植入窗口期。胚胎植入的质量决定了后续妊娠事件的正常与否甚至结局。以人为例，部分胚胎在窗口期外也能植入，但常导致胚胎丢失［10］。因此，准确的窗口期判
断对于临床辅助生殖实践至关重要。目前，临床上主要采取三维超声、宫腔镜以及子宫内膜活检等手段对子宫接受态进行评估，但是这些技术还远远不够，进一步研究子宫接受态建立过程中的关键事件和关键因子，可大大提高我们对这一过程的预判和掌控。
子宫腔上皮需要经历一个动态的上皮极性消失和上皮连接重构的过程，为囊胚滋养层细胞接触子宫上皮而后到达基质做准备。最新报道采用共聚焦成像联合3D图像分析技术，可以清晰显示接受态建立过程中，小鼠系膜侧腔上皮向系膜对侧发生皱褶并形成隐窝，以及胚胎植入诱导子宫腺管开口由朝向宫腔内转而朝向植入位点的动态过程［11］，并且证实人子宫内膜上皮亦存在类似变化。该报道打破了既往主要采用组织切片的形态学检测子宫内膜变化的
旧格局，实现了检测方法学的新突破。
雌激素（estrogen，E）和孕酮（progesterone，P）是促使子宫处于接受态的最主要调控激素。雌激素和孕激素受体各有两种，分别为ERα/β（estrogen receptor α/β）和PR-A/B（progesterone receptor A/B），其中ERα和PR-A分别是调控子宫接受态建立的主要受体。在小鼠体内，雌激素作用于基质细胞内的ERα，通过旁分泌方式促进子宫上皮细胞增殖，之后上皮和基质细胞内的ERα共同作用促使上皮细胞分化；P作用于上皮和基质细胞内的PR，拮抗雌激素诱导的上皮细胞增殖效应，同时促进基质细胞的增殖。人类胚胎植入的过程也伴随着雌激素水平逐渐上升，但ERα和PR的表达在增殖期水平较
高，进入分泌期后逐渐下降。这种伴随月经周期而发生变化的PR表达模式一旦改变，则女性不孕症的发生率显著增高［12］，提示雌孕激素水平及其受体表达的异常往往会导致胚胎植入失败。小鼠研究表明，孕马血清促性腺激素（pregnant mare rum gonadotropin，PMSG）联合hCG刺激卵巢后，表现出随着用药剂量的增加，胚胎植入率越来越低甚至植入完全失败［13］。另一篇文献也报道了卵巢刺激导致妊娠第1～2天的子宫上皮PR及其下游同源盒基因A10（homeobox A10，Hoxa10）mRNA水平显著低于正常小鼠，最终表现为着床率降低［14］。基于以上证据衍生出一个疑问：人类辅助生殖技术中也常进行卵巢刺激，由此产生的体内过高的雌孕激素是否也会影响胚胎植入？有文献报道，高雌激素水平抑制核转录因子κB（nuclear factor κB，NF-κB）的激活，导致人子宫上皮细胞凋亡而降低胚胎植入率［15］。最新的证据亦证实，人永生化子宫上皮细胞暴露在高水平雌激素中，可导致大量的植入关键分子表达异常［16］。反观临床使用的卵巢微刺激促排方案或者自然周期方案对雌孕激素水平影响较小，是否更利于妊娠率的提高，尚有待临床进一步验证。IVF周期中的卵泡穿刺取卵可能导致卵巢内颗粒细胞的丢失，雌孕激素的分泌减少，尤其是孕酮，是否导致妊娠率的降低尚未可知。目前的做法是常规使用孕酮制剂维持正常的雌孕激素比例，但肌肉注射、口服或是阴道给药，几种方式孰优孰劣尚未达成共识。另外，鉴于低孕酮相关的黄体功能不足是胚胎植入失败和早期胚胎丢失的主要原因，临床常规给予不明原因复发性流产的患者补充孕酮，多数文献报道这种做法可以起到预防流产和延长孕周的效果，然而最新的研究结果提示，孕酮补充预防流产还存在争议［17］。因此，有关是否补充孕酮及适应人群的问题有待统一。
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临床IVF辅助生殖技术移植优质胚胎却发生获得生化妊娠或者反复着床失败的患者，考虑存在“植入窗”前移或者推后的情况，可以借鉴上述胚胎植入过程中已经证实的标记分子，针对不同个体，通过分子标志物表达的检测确定其特异的植入窗口期，实施个体化移植策略，提高辅助生殖技术治疗成功率。
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囊胚-子宫同步互作完成胚胎植入
获得植入能力的囊胚和处于接受态的子宫相互作用来完成胚胎植入。该过程人为划分为3个阶段：定位期、黏附期和侵入期。
小鼠中伴随着囊胚的定位，胚轴建立和子宫腔闭合同步发生。研究证实，Notch信号通路分子Rbpj介导了囊胚在子宫内的精准植入和胚轴与母体体轴方向的一致，进而影响胚胎的正常发育［18］。与小鼠类似的是，IVF妊娠患者发生“双胎消失综合征”，可能的原因是植入时胚胎过于拥挤，导致一个胚胎被另一个所吸收。大多数报道认为该综合征的发生率虽然较低，但围产期结局差于自然受孕出生的婴儿［19］，甚至有幸存儿严重出生缺陷的报道。提示我们在临床工作中以保障妊娠率为前提，应尽量减少胚胎移植个数以减少类似情况的发生。
楷书子宫腔的闭合有利于囊胚锚定于子宫壁。小鼠子宫上皮Na+通道（ENaC）定位于子宫腔上皮和腺上皮。有报道称高水平雌激素抑制小鼠ENaC表达，导致宫腔内液体异常积聚，影响囊胚的宫腔定位和
黏附，胚胎植入率大大降低［20］，孕酮则以相反的作用促进子宫内液体的吸收。血清和糖皮质激素调节激酶1（rum and glucocorticoid regulated kina 1，SGK1）在围植入期表达短暂上调，主要负责离子和溶质跨膜转运。小鼠体内的SGK1过表达能够抑制ENaC表达，导致植入失败。在人类中，不明原因不孕患者的子宫腔上皮SGK1表达显著上调，而表达下降则与反复自然流产密切相关［21］，提示SGK1在人类的胚胎植入过程中也十分重要。
囊胚和子宫间的互作对于胚胎植入和启动后续的蜕膜化过程至关重要。小鼠研究证实，多种细胞因子、生长因子、转录因子、黏附分子和脂质介质如胰岛素样生长因子（insulin-like growth factor，IGF）、整合素（integrin）等共同参与这个过程。hCG是来源于人类胚胎的最早的激素信号，植入前的囊胚即可分泌hCG，作用于子宫内膜hCG受体，抑制胰岛素样生长因子结合蛋白-1（insulin-like growth factor binding protein-1，IGFBP-1）和巨噬细胞集落刺激因子（macrophage colony stimulating factor，M-CSF）的表达，刺激白血病抑制因子（leukaenia inhibitory factor，LIF）、血管内皮生长因子（vascular endothelial growth factor，VEGF）和基质金属蛋白酶-9（matrix metalloproteina-9，MMP-9）的分泌，介导囊胚-子宫互作促进胚胎的植入［22］。宫腔内注射hCG是临床上提高辅助生殖技术妊娠率的方法之一，但是文献报道的效果不一。近年来有关细胞外囊泡（extracellular vesicles，EVs）的研究也越来越多，作为一种细胞外分泌的特殊方式，EVs能够介导细胞间的通讯而促进许多生理和病理过程，如人子宫上皮细胞体外培养提取的EVs能调节囊胚滋养层细胞的黏附［23］。这些研究都为胚胎植入过程中的母胎互作提供了新视角。
子宫肌层处于合适的舒张状态也有利于胚胎植入的发生。研究报道，小鼠子宫上皮β2肾上腺素受体在围植入期的表达有短暂性升高，其异常激活会导致胚胎在宫腔内不均匀的空间分布，引起胚胎植入过度拥挤，继而胚胎丢失［24］。有意思的是，临床观察也发现在IVF辅助生殖技术胚胎移植后，移植入宫腔的液体移动的距离与子宫蠕动次数正相关，而与临床妊娠率负相关［25］，强调了子宫收缩增强导致的宫腔压力增高也不利于胚胎黏附和植入。
对临床生殖医学的借鉴与展望
模式动物的研究极大的促进了我们对于胚胎植入过程的理解，进而推进解决临床问题。需要指出的是，人体内的胚胎植入过程以及植入过程中的重要标记分子和模式动物可能存在较大的差异，比如小鼠体内囊胚休眠、雌孕激素调控子宫上皮和基质互作促进子宫进入接受态、上皮细胞分化同时形成隐窝等待囊胚归巢等过程在人体内尚未证实。这些问题一部分是种系差异所导致，另一部分可能是由于伦理的限制无法开展人类在体研究工作，因而无法证实某些机制或者标记分子为小鼠和人类所共有。为了弥补这一缺陷，需要基础研究紧密联系临床工作，尽量借助可以获得的人类标本来开展研究。此外，囊胚-子宫互作研究是胚胎植入这一连续过程里面最难开展的环节，这是由植入过程的在体性质所决定的。近年来，采用人工基膜或者球状体为支撑，子宫上皮细胞、基质细胞、胚胎或者胚胎替代物共培养的人类胚胎植入过程的体外研究体系已日臻完善，可以帮助我们深入了解这一过程［26］。最新报道的人子宫细胞来源的类器官体外培养体系的建立，也为我们研究生殖常见疾病提供了新方法。
胚胎植入的过程涉及到胚胎和子宫两个方面。既往对于胚胎植入过程的基础研究大多着眼于胚胎，随着对胚胎发育模式与规律认识的加深和各类筛选技术手段的发展，我们在临床工作中已经有一定的手段方法来评价和获得优质胚胎；同时，更应侧重加强对子宫内膜容受性的评价方法，尤其是无创性地预测评估子宫内膜状态对于临床辅助生殖实践有重要意义。只有我们对于两者有充分的理解和认识，才有可能在未来的临床实践中实现妊娠率的进一步提高和优生优育。
