质粒系列之再谈⽆缝连接--Gibsonasmbly
1. 我们⽤两篇⽂章的篇幅⼤概讲了⼀遍质粒⾻架及其各个要素的介绍：
解剖式学习⼀个质粒结构--update
质粒系列之什么是质粒
2. 再谈了最传统的限制性克隆：学习电脑制表格
质粒系列之限制性克隆--restriction cloning
3. 前⾯还夹杂的讲过⼀些piggybac、gateway、RMCE的⼀些内容：
基因编辑如何换药不换汤
4. 慢病毒系列也有讲过两篇：
团队作案HEK293，史上最强搬砖细胞
不想再⽤慢病毒了，我还有什么别的选择吗？piggyBac transposon
5. 此外我们本还有⼀个CRISPR screening的专题，只有开头，未得完善：精准⼤海捞针--5. CRISPR screening专题
每次都想要⼀篇⽂章的篇幅讲完，但知识总是越学越知道⾃⼰的⽆知，于是每次就像打补丁⼀样这⾥打⼀下那⾥打⼀下，导致⽂章都不成系列，⼗分松散。关于Gibson asmbly其实我之前也讲过，只是都不记得放在哪⼀篇⾥了。这是最近学习的笔记。
限制性克隆所谓成也限制性，败也限制性，限制性克隆的最⼤的限制来源于其“限制性。Gibson asmbly不依赖限制性内切酶，可⼀步完成多个DNA序列的组装，⼤⼤提升DNA组装速率，同时还可降低载体⾃连的概率，是多⽚段DNA序列连接的⾸选⽅式。下表简单⽐较两种⽅法的特点。
限制性克隆Gibson asmbly
实
验
原
理
酶切连接同源重组
⼯具酶限制性内切酶、DNA连接酶；必要时需去磷酸化及磷
酸化
核酸外切酶（5‘ or 3'）、DNA聚合酶、DNA连接酶
酶
切
位
点
需特异性酶切位点不依赖特异性酶切位点
末端插⼊⽚段与载体粘性末端需互补，平端可直连，但平端
更易⾃连。
任意末端都可经由PCR加⼊overlap序列，达到有“同源”可
重组的效果。
优点1. 单次实验花费较低，设计简单；2. 分步进⾏，易于
查错；3. 适⽤于简单的⽚段插⼊，以及中等⼤⼩⽚段
扩增⽆法达成或易出错时。
1. 效率⾼，操作简单，⼀步到位；
2. 不依赖酶切位点，适⽤于
任意⽚段。
缺
点和隐患1. 依赖特异性酶切位点，需多步进⾏，操作复杂，耗
时较长；2. 需备多种限制性内切酶，酶存放时间过久
易失活；3. ⼤⽚段（> 6 kb）连接效率不⾼。
1. 需要设计引物并通过⾼保真PCR扩增⽚段，⽚段过长不易扩
增且易出错；2. 同源重组效率依赖于同源臂的选择，载体内有
相似序列会影响同源重组效率，也有错配可能。
1. ⼀览众⼭⼩
这查资料的时候发现特别有趣，原来⽆论是限制性克隆还是Gibson asmbly，都是出⾃同⼀个实验室/机构。
image
左边这位Hamilton Smith教授是II类限制性内切酶的发现者之⼀，并因这⼀发现与Daniel Nathans和Werner Arber共同获得了1978年的诺贝尔⽣理学和医学奖。⽽右边的Daniel Gibson 于2004年到 J. Craig Venter Institute(克雷格·⽂特尔研究所 )的 Hamilton Smith组做博后，负责细菌基因组合成的相
关课题。⽽ J. Craig Venter则因其牵头⼈类基因组计划⽽闻名，创⽴了 J. Craig Venter Institute及Synthetic Genomics Inc. (SGI) 公司
2. 发现之初炒粿
从2004年Gibson⼊职到2008年，不到4年时间，Gibson和Smith在Science上共同发表了酵母细胞完成⽀原体基因组组装的⽂章，⽽这篇⽂章⽤到的DNA⽚段组装⽅法则在2009年发表于Nature Methods
papers
从上图Nature Methods⽂章的摘要可看到，Gibson使⽤5‘核酸外切酶，DNA聚合酶和DNA连接酶完成了多DNA⽚段的⼀步连接，⽽这就是我们现在常⽤的Gibson asmbly。
3. 实验过程⽰意
⼀般实验室都直接购买配好的Gibson asmbly mixture，但也可⾃⾏购买T5 核酸外切酶、DNA聚合酶以及DNA连接酶配置。Gibson操作简单，具体过程和步骤都写在下图中：
宫商角羽schematic graph土豆皮
需要注意的事项有：
(1) ⼀般说明书推荐所有⽚段都⽤PCR⼿段获得，但长⽚段会有因PCR⽽引⼊突变，因此，⾻架⼤⽚段可采⽤限制性内切酶处理后获取。
(2) 如果两端序列中有多个同源序列，则会有错误同源重组的可能，例如Loxp序列等等。
4. 核酸内切酶 vs 核酸外切酶
对⽐限制性克隆和Gibson asmbly，最⼤的区别是⽆需特定的酶切位点，然⽽实际上还是需要overlap的悬端，只是这个悬端可以由PCR带来，同时核酸外切酶的末端修整，使得overlap序列暴露，从⽽完成同源重组。那么核酸内切酶和核酸外切酶的差别和分类我们可以简单来学习⼀下：
Endo & exo
从名字来看，内切酶切的是序列内部，外切酶切的则为外部（5’或3‘末端），具体的⽐较可如下表：
Ba
sis
fo
r
Co
税收怎么计算m
pa
ris
on
Endonuclea Exonuclea
定义切割多核苷酸内部磷酸⼆酯键的酶类
可以⼀次从5 '或3 '端切割多核苷酸链中
的DNA序列的酶类
分类3类：I型和III型是⼤型多亚基复合物，包括内切酶和甲基化酶活性； I型可以
切割距离识别序列⼤约1000个碱基对或更远的位点，它需要ATP作为能量
来源 ；III型则可 可识别短的不对称序列，切割距离识别序列外约25个碱基
对的位点，在这个过程中也需要ATP ；⽽II型则由Hamilton发现， 它们是
内切酶的简单版本，通常识别短回⽂序列并直接切割该序列，在降解过程中
不需要ATP
真核⽣物和原核⽣物有三种类型的外切
酶参与mRNA的正常转换: （I型）5’ -
3‘外切酶 (Xrn1)，这是⼀个依赖的脱
三省吾身是什么意思
壳蛋⽩; （II型 ）⾮依赖性 3′ - 5′ 核
酸外切酶；（III型）poly(A)特异性3’ -
5‘外切酶。
活
性迟滞期由于某些核酸内切酶是限制性内切酶，因此在该酶类识别到特定位点之前，
该酶不具活性，此为活性迟滞期。
⽆
减脂增肌切
割
结
果
由于切割的是序列内部，因此产物也是多核苷酸裂解DNA序列，产⽣单个核苷酸或核苷
末
端
可以是平端或粘性末端粘性末端
特
异
性
限制性内切酶可⽤于切割DNA序列中的特定位点。⼀般⽆特异性
防
御鹿晗和迪丽热巴
属
性
部分可防御外来病原体并⽆防御外来病原体的属性
对
环
状
DN
A
的
效
果
可切割对环状DNA的活性低于现状DNA
可
抑
制
性
内切酶硫代磷酸酯键连接的核苷酸仍具有活性，除⾮整个序列都是这个键。对硫代磷酸酯连接的核苷酸不具活性
结语
两种⽅法⾃是各有优缺，虽⽬前多⽤Gibson asmbly，但限制性克隆仍然常⽤。限制性内切酶种类繁多，其中Type IIS克隆更是被称为Golden Gate cloning。从操作时间来看，Golden Gate是最简单的⽅法之⼀，单管内酶切和连接可在30分钟内完成。由于Type IIS酶切不保留酶的识别位点，因此连接产物的形成是不可逆的，连接效率⼏近100%。且Golden Gate 克隆限制性克隆需分步完成的缺点，在同⼀管内可完成多达10个⽚段的连接，果⼦⽼师称之为--质粒改造的王者。下周，我们将会聊聊这Golden Gate cloning，敬请期待。
