Overlap extension PCR

更新时间:2023-06-24 10:42:01 阅读：评论：0

1. 利用Overlap extension PCR构建突变以及截短体

24.1点突变体设计

利用PCR技术[14]关于中国的资料，获取各个点突变体。

(1)设计引物

如下设计4个引物, 引物A和B相互互补并含有突变的氨基酸相对应的核苷酸突变。5’端和3’端引物与此基因全长基因的克隆引物相同。引物设计的通常原则参考stratagene公司的QuikChange定点突变试剂盒说明书中的引物设计原则。

(2) PCR反应扩增突变体

第一步：分别做两个PCR, 扩增待突变基因的两个半边。

配置如下反应体系：

PCR I

菠萝古老肉的做法

间歇期

模板	1.0μl
10×PCR Buffer	生日蛋糕真实图片5.0μl
dNTP Mixture （10mM）	1.0μl
Primer 5’（ 25M ）	1.0μl
Primer B（ 25M ）	1.0μl
Hotstart High Fidelity 酶（Rhche）	0．25μl
ddH2O	39.75μl
终体积	50.0μl

PCR II

模板	1.0μl
10×PCR Buffer	5.0μl
dNTP Mixture （10mM）	1.0μl
人类星球Primer 5’（ 25M ）	1.0μl
Primer B（ 25M ）	1.0μl
Hotstart High Fidelity 酶（Rhche）	0．25μl
ddH2O	40.75μl
终体积	50.0μl

按如下程序进行热循环：

95℃ 2min

56℃ 1min 15－30个循环

72℃ 1.5min

72℃ 10min

4℃

注: 依据不同引物的Tm值和所扩增的基因长度设定退火温度和延长时间，一般1kb/min。

第二步：在PCR III 中利用PCR I和 PCR II回收产物作为模板。

PCR III

女人气血不足

模板	1.0μl
10×PCR Buffer 吐故纳新	5.0μl
dNTP Mixture （10mM）	1.0μl
PCR I 回收产物	1.0μl
PCR II回收产物	1.0μl
Hotstart High Fidelity 酶（Rhche）	0．25μl
ddH2O	40.75μl
终体积	50.0μl

按照上述条件进行8个循环后，加入5’端和3’端引物各1l，继续进行下一的循环：

95℃ 2min

相逢是首歌作文95℃ 2min

56℃ 1min 25个循环

72℃ 1.5min

72℃ 10min

4℃

取PCR产物进行1%琼脂糖凝胶电泳鉴定并回收片段，之后进行酶切和连接，转化入感受态细胞并鉴定。

24.2缺失突变体和替换突变体构建：

在突变体的衔接处设计一个酶切位点，例如EcoRI等，再设计此位点上游和下游片段的引物，并在片段衔接处的引物上均携带此酶切位点，将两段序列用此共有的酶切位点分别克隆至表达载体上，即可获得基因的缺失。替换突变体采用的方法也是Overlap extension PCR，基本原理类同于点突变体的设计。

本文发布于:2023-06-24 10:42:01，感谢您对本站的认可！

标签：突变体引物设计基因

留言与评论（共有 0 条评论）