纳米金标记DNA的生物传感器
罗贵华，徐怀德3，高志贤3①，胡志华，周焕英①，刘楠①
(西北农林科技大学食品科学与工程学院，陕西杨凌712100)
摘要：目的利用纳米金标记DNA以提高传感器的检测灵敏度，为建立方便、快速、准确地检测食品中李斯特菌的方法提供依据。方法利用自组装法，将5′端巯基修饰的单链DNA固定在金电极上，然后与纳米金标记的探针进行杂交。结果传感器与标记有胶体金的探针杂交频率减少了207H z，与未标记有胶体金探针杂交频率(减少了52H z)相比提高了3倍。结论采用纳米金标记的探针可提高传感器的检测灵敏度，在食品安全检测中具有重要意义。
关键词: 生物传感器; 纳米金标记DNA; DNA固定; 杂交四议两公开
学习手册 中图分类号:Q523 文献标识码:A 文章编号:1001-5248(2007)02-0091-03
压电传感器已广泛应用于生物传感领域〔1〕。纳米材料在传感器中的应用使DNA杂交检测的灵敏度大大提高，成为研制DNA传感器的首选材料〔224〕。我们用纳米金标记DNA后再与传感器上固定的探针进行杂交，以便更好地检测食品中细菌。
1 材料与方法
1.1 试验材料 固定液(10mm ol・L21Tris-HCl,0.2 m ol・L21NaCl);Piranha液(浓硫酸:30%双氧水=3∶1);10mm ol・L21磷酸缓冲液;K3Fe(C N)6;K4Fe(C N)6。李斯特菌毒力基因片段(上海生工):5′-SH-GG C AAC CTC GG A G AC TT A CG C-3′(P21),5′-SH-G CG T AA G TC TCC G AG G TT G CC-3′(P21′)。CHI401A电化学工作站(CHIInstrument,US A)。
1.2 试验方法 (1)电极先用超声波清洗10min，取出后用纯净水冲洗，然后将Piranha液滴于金电极表面反应10min，去离子水反复冲洗后再用丙酮和用无水乙醇冲洗，最后用纯净水冲洗干净,N2干燥后测其频率f0。(2)参照文献〔5〕制备胶体金。(3)试验所用的离心管先经硅化处理，然后烘干。将P21加入到新制备的纳米金溶液中室温振荡24h后，加入到pH7.9的10mm ol・L21磷酸缓冲溶液中，并加入
基金项目：国家自然科学基金项目课题(N o.30571566)
天津市自然科学基金(N o.053607111)
作者简介：罗贵华(1981-)，女，硕士研究生。从事饮料、天然产物提取和食品安全研究。
3通讯作者
①军事医学科学院卫生学环境医学研究所2m ol・L21NaCl使其终浓度为0.1m ol・L21，振荡16h 后再
次加入NaCl使其终浓度为0.2m ol・L21，继续室温振荡24h。最后，将金胶标记的DNA探针溶液以14000r・min21离心30min，除去上层清液，红色油状沉淀用pH7.4的0.2m ol・L21NaCl-10mm ol・L21磷酸缓冲溶液洗涤2次后，再离心分离，条件同上，以除去未反应的过量寡聚核苷酸。所制得的探针用pH7.4的0.2m ol・L21NaCl-10mm ol・L21磷酸缓冲溶液稀释成一定的浓度，保存于4℃低温下备用。(4)将P21′用固定液稀释成一定的浓度梯度。每个电极加入配置好的固定液80μL,25℃固定2h后用固定液洗净，再用蒸馏水清洗，干燥后测频率f1，由△f1= f1-f0确定探针的固定量。(5)将固定有探针的电极放入检测池中，加入80μL一定浓度纳米金标记互补的探针，在30℃下杂交2h，然后用P BS洗涤，再用去离子水清洗,N2干燥后测频率f2，由△f2=f2-f1确定杂交量。
2 结果与讨论
2.1 胶体金颗粒的鉴定 用紫外分光光度计对胶体金进行扫描，见图1。由图1可见，其主峰宽度较小，表明制备的胶体金颗粒较均匀，最大吸收波长(λmax)为522nm，表明其直径约为16nm。
帮助用英语怎么说2.2 探针在胶体金上的固定 探针修饰的胶体金易吸附在离心管的管壁，室温静止放置3d几乎所有的胶体金都被吸附，所以本试验在制备纳米金标记探针前先将离心管硅化处理，并且整个修饰过程在摇床中进行，结果表明，以此方法制备的探针修饰
胶体金几乎不与管壁产生吸附。根据其紫外吸收光谱图(图1)可知：在260nm有一个吸收峰，说明SH -
ssDNA固定在纳米金上，并且纳米金的最大吸收峰发生右移，约为526nm。固定有探针纳米金的吸光度与未固定前相比有所下降，这是因为纳米颗粒在离心过程中有一部分同上清液一起被丢弃。电解质能破坏胶体金颗粒的外周水化层，从而打破胶体的稳定状态，使分散的单一金颗粒凝聚成大颗粒，而从液体中沉淀下来。固定有探针的胶体金稳定性大大提高，当探针加入胶体金溶液24h后，加入NaCl 溶液，胶体金不发生凝聚，这也说明了探针固定在胶体金上。纳米金修饰SH-ssDNA时，金颗粒必须先和SH-ssDNA在水中修饰，然后逐渐提高离子强度。实验观察了0.1、0.2、0.3m ol・L21Na+对纳米金标记探针的影响，结果表明，高离子强度可提高SH -ssDNA在金颗粒上的覆盖率，原因可能为：提高离子强度可能使SH-ssDNA在金颗粒上由平躺变为直立，增加SH-ssDNA与金颗粒的接触量，并且高的离子强度可能降低SH-ssDNA间的斥力，提高SH -ssDNA与金颗粒间的作用力。SH-ssDNA间的斥力降低，使更多的SH-ssDNA吸附在金颗粒上，提高SH-ssDNA在纳米金上的覆盖率〔4〕，但是过高的离子强度可能使胶体金发生凝聚，所以本试验选择终离子强度为0.2m ol・L21。
观察了0.1、0.5、1.0、3.0、5.0μm ol・L21的探针浓度对纳米金标记探针的影响，结果表明：探针浓度越高,SH-ssDNA在金颗粒表面的覆盖率越高，金颗粒稳定性越好，但是过高的探针浓度修饰的胶体金在与电极上互补的探针杂交时杂交率降低，这是因为SH-ssDNA之间的作用力增大的缘故，所以本试验选择修饰探针的浓度为3.0μm ol・L21。
2.3 探针在电极上的固定
2.3.1 探针在电极上固定量的确定 考察了0.01、
图1 胶体金的紫外吸收光谱0.05、0.1、0.3、0.5、0.8、1.0、1.5、2.0μm ol・L21的探针浓度梯度在电极上的固定情况。不同浓度探针(μm ol・L21)引起的传感器频率变化(-△f1,H z)分别为10.3±1.7、18.7±1.7、42.0±1.0、68.7±2.7、110.3±2.3、148.3±2.3、133.0±4.0、121.0±3.0。当浓度小于1.0μm ol・L21时，随着探针浓度的增大，频率变化也随之增大；当探针浓度进一步增大，频率略有下降。这是因为达到一定的探针浓度后，探针固定达到饱和，继续增加探针浓度，固定量减少，这可能与探针之间相互作用力有关。
2.3.2 固定液pH的选择 配制不同pH的固定液(10mm ol・L21Tris-HCl,0.2m ol・L21NaCl)，使pH分别为2.9、4.5、7.0、7.9、9.0，依次用以上固定液稀释探针使之浓度为1.0μm ol・L21，然后与电极进行自组装，频率变化(-△f、H z，表1)。在酸性环境中，探针在电极上的固定量最大；而在中性环境中，探针的固定量最小。但是将固定化的探针用于杂交时，在中性环境中固定在电极上的探针杂交率是最大的，而在酸性条件下固定的探针很难与靶DNA杂交，可能是在酸性条件下，探针分子通过质子化腺嘌呤结合在电极表面，影响了与靶DNA的杂交能力。由于pH为7.9时，杂交量最大，所以以下试验选择固定液的pH为7.9。
2.3.3 电化学的测定 循环伏安法表征SH-ssD2 NA在金盘电极的自组装情况。本实验采用三电极系
统，以固定有探针的金电极为工作电极，饱和甘汞电极为参比电极，铂电极为对电极。以5mm ol・L21 Fe(C N)63-/Fe(C N)64-为底液，测电极固定探针前后的循环伏安曲线。分别考察了0.70～-0.1V范围内裸金电极和SH-ssDNA/Au电极在5mm ol・L21 Fe(C N)63-/Fe(C N)64-循环伏安信号(图2)。由于SH-ssDNA自组装膜对电子传递有阻碍作用。电极表面经0.5μm ol・L21的SH-ssDNA修饰后，表面形成一层致密的膜，一定程度上阻碍了铁离子在电极表面的电子传输。由图2可知，与裸金电极相比, Fe3+/Fe2+的氧化还原峰电位之差增大，电流强度减
表1 pH值对探针固定后和杂交后频率
的影响(H z, x±s,n=3)
pH固定后杂交后
2.9235.0±2.01
相互适应3.7±3.3
4.5196.7±3.72牡竹
5.0±3.0
7.0122.3±2.7112.7±2.3
7.9148.3±3.3123.0±2.0
9.0165.0±2.043.3±3.7
图2 Fe3+/Fe2+在裸金电极(1)和
SH-ssDNA/Au(2)电极的循环伏安曲线
小，说明SH-ssDNA固定在金电极表面。
2.4 杂交 电极先用0.5μm ol・L21的SH-ssDNA修饰，然后与0.5μm ol・L21未标记有胶体金的探针和标
记有胶体金的探针分别杂交，未标记有胶体金的探
针固定后和杂交后的频率变化(-△f,H z)分别为60.7±3.3和52.0±2.0，标记有胶体金的探针分别为63.0±3.0和207.3±4.7。杂交后，胶体金的颜色由酒红色变为无色，说明胶体金与电极上的探针发生了杂交反应。传感器与标记有胶体金的探针杂交频率减少了207H z，与未标记有胶体金探针杂交频率改悲伤的纯音乐
变(52H z)相比提高了3倍，这是因为胶体金的加入使结合相同探针量电极上的质量负载增加所致。同时，本试验考察了不同浓度探针固定在电极后电极结合胶体金标记探针的情况，表明电极结合胶体金的能力随着探针固定量的增加而显著提高。
本试验将纳米金标记于人工合成的5′端修饰有巯基的单链DNA上，再与固定在金电极表面的互补单链DNA杂交，使传感器的灵敏度明显提高，与未标记有纳米金的样品杂交相比，灵敏度提高了3倍。
参考文献:
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BIOSENSOR USING G O LD NANOPARTIC LE2O LIG ONUC LEOTIDE DNA
L U O G ui-hua,XU H uai-de,GAO Zhi-xian,HU Zhi-hua,
ZH OU H uan-ying,LIU N an
(C ollege of F ood Science and Engineering,N orthwest Sci-tech Univeisity
of Agriculture and F orestry,Shanxi Y angling712100China)
ABSTRACT:Objective T o im prove the nsitivity of bions or by using g old nanoparticle-olg onucleotide DNA,s o as to provide the basis for establishing a convenient,rapid and accurate method for detecting Listeria m onocytogenes in food. Methods DNA single strand marked with thiol group at the5‘end was imm obilized on the surface of g old electrode.The electrode were hybridized with g old nanoparticle-olig onucleotide DNA probes in this DNA bions or.R esults The fre2 quency of DNA bions or with labeled g old nanoparticle-olig onucleotide DNA probe decread by207H z,which was3 times as high as unlabeled probe(52H z).Conclusion The nsitivity of DNA bions or with g old nanoparticle-olig onu2 cleotide DNA probe is obviously im proved.It is of im portance in detection of food safety.
KE YWOR DS:bionsor;gold nanoparticle-oligonucleotide DNA probe;DNA immobilization;hybridiza2 tion
(收稿日期:2006-10-17；修回日期:2006-12-20)
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