壳聚糖有广谱抗菌性，且对人体无毒副作用，深入研究有望研制出一种新的抗菌药物。关于壳聚糖抗菌特性的各种影响因素研究很多，但得出的结论并不一致。管云林等［１］与夏文水等［２］分别采用Ｓｔｒｅｐｃｏｍｙｃｅｓａｕ－ｒｅｕｓ（金黄色葡萄球菌）和Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａｃｏｌｉ（大肠杆菌）作为试验菌株，发现随壳聚糖的分子量降低抗菌性能增强。而ＫｅｉｓｕｋｅＵＥＮＯ等报道对Ｓ．ａｕｒｅｕｓ和Ｅ．ｃｏｌｉ，平均分子量小于５０００的壳聚糖不仅没有抗菌作用，反而能促进细菌的生长，而分子量约为９３００的壳聚糖几乎可以完全抑制细菌生长［３］。Ｙｏｕｓｏｏｋ等报道分子量为４万的壳聚糖在浓度为０．５％时，对Ｓ．ａｕｒｅｕｓ和Ｅ．ｃｏｌｉ的杀灭率为９０％；分子量为１８万的壳聚糖在浓度为５００ｍｇ／ｋｇ时，对Ｓ．ａｕｒｅｕｓ和Ｅ．ｃｏｌｉ的杀灭率几乎为１００％［４］。为了验证壳聚糖的抗菌性能，探讨其抗菌作用的机理，有必要继续对壳聚糖的抗菌特性进一步地研究。本文选择革兰氏阴性菌Ｅ．ｃｏｌｉ作为试验菌株，用自制的不同分子量的壳聚糖作了抗菌性试验，研究了壳聚糖分子量与其抑菌性能之间的关系，并对壳聚糖的抑菌作用机理作了比较深入的探讨，为壳聚糖在食品防腐中的应用提供科学依据。
１试验仪器和材料
１．１实验仪器
ＬＤＺＸ４０ＣＩ型立式自动电热压力蒸汽灭菌锅：上海中安医疗器械厂；ＤＨＧ９０７０Ａ型电热恒
温干燥箱：上海益恒实验仪器有限公司；生化培养箱：国华电器；ＳＮＣＪ１ＢＵ无菌操作台：苏净集团安泰公司；江南牌光学显微镜；血球计数板；索氏萃取器。
１．２试验材料
１．２．１供试菌
革兰氏阴性大肠杆菌（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａｃｏｌｉ）：由天水师
不同分子量壳聚糖对大肠杆菌抑制作用规律
及其机理探讨
冯小强１，杨声２＊，王廷璞２，苏中兴１＊，梁凯强２，雷新有２（１．兰州大学化学化工学院，甘肃兰州７３００００；２．天水师范学院生命科学与化学学院，甘肃天水７４１００１）摘要：考察了不同分子量的壳聚糖对大肠杆菌的抗菌、抑菌作用的影响规律，并利用壳聚糖的席夫碱反应对其氨基加以保护，初步提出了壳聚糖对大肠杆菌的抗菌机理。研究结果表明，壳聚糖分子量越小，对大肠杆菌的抗菌作用越明显；壳聚糖对大肠杆菌的抑菌作用与其氨基的质子化有关。
关键词：壳聚糖；大肠杆菌；抑菌；规律；机理
中图分类号：ＴＳ２０２．３文献标识码：Ａ文章编号：２０５４－０５７１（２００７）０２－００１６－０３
Ａｎｔｉｂａｃｔｅｒｉａｌａｃｔｉｖｉｔｙｏｆｃｈｉｔｏｓａｎｗｉｔｈｄｉｆｆｅｒｅｎｔｍｏｌｅｃｕｌａｒｗｅｉｇｈｔ
眼见为实英语ｏｎＥｓｃｈｅｒｉｃｈｉａｃｏｌｉａｎｄｔｈｅｐｏｓｓｉｂｌｅｍｅｃｈａｎｉｓｍ
ＦＥＮＧＸｉａｏ－ｑｉａｎｇ１，ＹＡＮＧＳｈｅｎｇ２＊，ＷＡＮＧＴｉｎｇ－ｐｕ２，ＳＵＺｈｏｎｇ－ｘｉｎｇ１＊，ＬＩＡＮＧＫａｉ－ｑｉａｎｇ２，ＬＥＩＸｉｎ－ｙｏｕ２（１．ＣｏｌｌｅｇｅｏｆＣｈｅｍｉｓｔｒｙａｎｄＣｈｅｍｉｃａｌＥｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ，ＬａｎｚｈｏｕＵｎｉｖｅｒｓｉｔｙ，Ｌａｎｚｈｏｕ７３００００，Ｃｈｉｎａ；
２．ＣｏｌｌｅｇｅｏｆＬｉｆｅＳｃｉｅｎｃｅｓａｎｄＣｈｅｍｉｓｔｒｙ，ＴｉａｎｓｈｕｉＮｏｒｍａｌＵｎｉｖｅｒｓｉｔｙ，Ｔｉａｎｓｈｕｉ７４１００１，Ｃｈｉｎａ）
Ａｂｓｔｒａｃｔ：ＴｈｅａｎｔｉｂａｃｔｅｒｉａｌｅｆｆｅｃｔｓｏｆｃｈｉｔｏｓａｎｗｉｔｈｄｉｆｆｅｒｅｎｔｍｏｌｅｃｕｌａｒｗｅｉｇｈｔｓｔｏＥｓｃｈｅｒｉｃｈｉａｃｏｌｉｗｅｒｅｓｔｕｄｉｅｄ．ＷｉｔｈｔｈｅｐｒｏｔｅｃｔｉｏｎｏｆａｍｉｎｏｇｒｏｕｐｂｙＳ
ｃｈｉｆｆ’ｓｒｅａｃｔｉｏｎ，ｔｈｅａｎｔｉｂａｃｔｅｒｉａｌｍｅｃｈａｎｉｓｍｗａｓｒｅｖｅａｌｅｄｐｒｉｍａｒｉｌｙ．Ｔｈｅｒｅｓｕｌｔｓｓｈｏｗｅｄｔｈａｔｔｈｅｓｍａｌｌｅｒｔｈｅｍｏｌｅｃｕｌａｒｗｅｉｇｈｔｏｆｃｈｉｔａｓｏｎｗａｓ，ｔｈｅｓｔｒｏｎｇｅｒｔｈｅａｎｔｉｂａｃｔｅｒｉａｌｅｆｆｅｃｔｗａｓ．ＴｈｅａｎｔｉｂａｃｔｅｒｉａｌａｂｉｌｉｔｙｏｆｃｈｉｔｏｓａｎｔｏＥ．ｃｏｌｉｗａｓｒｅｌａｔｅｄｔｏｔｈｅｐｒｏｔｏｎａｔｉｏｎｏｆａｍｉｎｏｇｒｏｕｐ．
Ｋｅｙｗｏｒｄｓ：ｃｈｉｔｏｓａｎ；Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａｃｏｌｉ；ａｎｔｉｂａｃｔｅｒｉａｌ；ｌａｗ；ｍｅｃｈａｎｉｓｍ
唐与新罗的关系
收稿日期：２００６－０４－２７
基金项目：天水师范学院科学研究基金资助（Ｘ３－０１）
作者简介：冯小强（１９８０－），男，甘肃平凉人，硕士研究生；杨声＊，教授；苏中兴＊，副教授，通讯作者。
ａ分子量５万的ＣＴＳ浓度为１．５％时的抑菌圈，ｂ分子量１００万的ＣＴＳ浓度为１．５％时的抑菌圈，ｃ１％ＨＡｃ的抑菌圈
图２壳聚糖对大肠杆菌的抑菌圈照片
Ｆｉｇｕｒｅ２．ＩｎｈｉｂｉｔｉｏｎｚｏｎｅｏｆｃｈｉｔｏｓａｎｆｏｒＥｓｃｈｅｒｉｃｈｉａｃｏｌｉ
图
１壳聚糖（ａ）、席夫碱壳聚糖（ｂ）的红外光谱
Ｆｉｇｕｒｅ１．ＩＲｓｐｅｃｔｒｕｍｏｆｃｈｉｔｏｓａｎ（ａ）ａｎｄｓｈｉｆｆｂａｓｅｃｈｉｔｏｓａｎ（ｂ）
范学院微生物实验室提供。１．２．２供试壳聚糖（见表１）
１．２．３培养基
牛肉膏蛋白胨固体培养基［５］。２试验方法
２．１低分子量及水溶性壳聚糖的制备２．１．１壳聚糖的降解
称取ＣＴＳ３２ｇ，加入２％ＨＡｃ４００ｍＬ，搅拌溶解后，再用分液漏斗缓慢加入５％Ｈ２Ｏ２２００ｍＬ，６０℃回流反应。反应到一定时间后，取样冷却、抽滤，滤液用氢氧化钠溶液调至ｐＨ１０，静置２ｈ后过滤，得非水溶性产品。滤液在５０℃减压浓缩，浓缩液用２￣３倍量的无水乙醇析出沉淀，静置过滤，无水乙醇洗涤数次至中性，冷冻干燥，得水溶性产品。２．１．２降解物分子量的测定
采用黏度法［６］。
２．２壳聚糖的氨基保护（席夫碱反应）
榜样作文500字［７］
将５＃壳聚糖１ｇ分散到５０ｍＬ甲醇中，加入３ｍｏｌ的甲醛，在室温下搅拌１６ｈ过滤，用甲醇在索氏萃取器中萃取４ｈ，再用乙醚洗涤，进一步除去残留的醛，空气干燥，即得到氨基被保护的产物。
２．３席夫碱改性壳聚糖的ＩＲ光谱分析
如图１红外光谱所示，３４５０ｃｍ－１处是形成氢键缔
合的－ＯＨ伸缩振动吸收峰与－ＮＨ２的伸缩振动吸收峰重叠而增宽的多重吸收峰，１５９９．６２ｃｍ－１处是氨基的
Ｎ－Ｈ特征吸收峰，１６５０ｃｍ－１处是酰胺吸收峰。比较图１中ａ和ｂ可以看出，在ｂ中，１５９９．６２ｃｍ－１的氨基的Ｎ－Ｈ特征吸收峰消失，这说明－ＮＨ２已经得到了保护。
２．４壳聚糖对大肠杆菌的抑菌试验
２．４．１菌种的活化
受试菌种接种于液体营养肉汤培养基内，在３７℃、转速为１００ｒ／ｍｉｎ的摇床内活化２４ｈ，使菌液达到一定浓度。２．４．２菌悬液的制备
将活化后的大肠杆菌用接种环挑取２环菌苔于无菌水中，用稀释平板计数法计数（见国标ＧＢ４７８９２－１９９４），制成含菌数约为１０６个／ｍＬ的菌悬液备用。２．４．３滤纸片法测定抑菌作用［８－９］
取φ１０ｍｍ的灭菌圆滤纸片放入不同浓度的壳聚糖溶液（１％的醋酸溶液为溶剂）中浸泡。将０．１ｍＬ菌悬液涂布在培养基平板上，用无菌镊子取浸泡过的圆滤纸片并贴于培养皿中，每皿贴３片。试验设置壳聚糖浓度分别为０．２％、０．４％、０．６％、０．８％、１．２％、１．５％、２％。
并以１％的醋酸为对照，对照样除不加壳聚糖外，其他条件与添加壳聚糖的培养基一致。每种浓度重复３次试验，在３７℃培养２４ｈ，测定圆滤纸片的抑菌圈直径。抑菌圈如图２所示。
型号来源
脱乙酰度／％分子量／（×１０４）
１＃浙江玉环县壳聚糖有限公司９８１００２＃浙江玉环县壳聚糖有限公司
９６８０３＃自制９５２０４＃自制９７１４５＃自制＞９５５６＃训诂
自制
－
５（水溶性）
表１供试壳聚糖Ｔａｂｌｅ１．Ｔｅｓｔｅｄｃｈｉｔｏｓａｎ
表２壳聚糖浓度为１．５％时，不同分子量壳聚糖的抑菌圈Ｔａｂｌｅ２．Ｉｎｈｉｂｉｔｉｏｎｚｏｎｅｏｆｃｈｉｔｏｓａｎｗｉｔｈｄｉｆｆｅｒｅｎｔｍｏｌｅｃｕｌａｒ
ｗｅｉｇｈｔａｔｔｈｅｃｏｎｃｅｎｔｒａｔｉｏｎｏｆ１．５％ＣＴＳ分子量／（×１０５）
抑菌圈直径／ｍｍ
０．５＞２１１．４１８２．０１７８．０１５１０
１４
表３不同浓度时５＃壳聚糖（分子量５×１０４）的抑菌圈Ｔａｂｌｅ３．ＩｎｈｉｂｉｔｉｏｎｚｏｎｅｏｆＮＯ．５ｃｈｉｔｏｓａｎ（ｍｏｌｅｃｕｌａｒｗｅｉｇｈｔｏｆ
５×１０４）ｄｉｓｓｏｌｖｅｄａｔｄｉｆｆｅｒｅｎｔｃｏｎｃｅｎｔｒａｔｉｏｎｓＣＴＳ浓度／％
抑菌圈直径／ｍｍ
０．２１３０．４１４０．６１６０．８１７１．２１９１．５＞２１２．０
＞２１
３结果与讨论
３．１壳聚糖对大肠杆菌的抑制作用规律
在试验中，先将壳聚糖浓度配制成１．５％，测定其对
大肠杆菌的抑菌圈，如表２所示。
从表２可以看出，不同分子量的壳聚糖对大肠杆菌都有一定的抑菌作用，但随着壳聚糖分子量的增加，其抗菌效果逐渐减弱。低分子量壳聚糖对大肠杆菌有较好的抑制作用，这与管云林［１］及夏文水［２］等的结论一致。测定不同浓度时５＃壳聚糖（分子量５×１０４）的抑菌圈，如表３所示。从表３可以看出，随着壳聚糖浓度的增加，其抑菌作用越明显，但当其浓度达到１．５％时，变化不再很明显，此即为最佳抑菌浓度。
３．２壳聚糖对大肠杆菌的抑制作用机理试验发现，当相同分子量（５万）的水溶性ＣＴＳ溶于１％ＨＡｃ中浓度为１．５％时，有一定的抗菌活性，其抑菌圈为φ１４ｍｍ￣φ１５ｍｍ，同１％ＨＡｃ（φ１２ｍｍ）相比，有一定的增强。但当将其溶于蒸馏水中时，无抑菌圈出现。为此，将分子量（５万）的壳聚糖通过席夫碱反应将其－ＣＨＯ加以保护，将其溶于１％ＨＡｃ中，配制成浓度为１．５％的溶液，其他同上，测定其抑菌圈，其抑菌圈为φ１２ｍｍ。而１％ＨＡｃ对大肠杆菌的抑菌圈为φ１２ｍｍ，这说明席
夫碱改性后的壳聚糖失去了抑制细菌的功能，同时也说明壳聚糖对大肠杆菌的抑制作用主要与－ＮＨ２的质子化有关。壳聚糖分子链上－ＮＨ２在酸性条件下易与Ｈ＋结合形成－ＮＨ３＋正离子，随着壳聚糖分子量的减小，其分子链上的单位－ＮＨ２含量增多，
对于细菌（带有负电荷）的静电引力增强，更多的细菌被絮凝、聚沉，其生长繁殖也随之减弱，即表现为壳聚糖的抗菌性随其分子量的减小而增强。另外，在酸性环境下，质子化氨中的Ｈ＋可以与营养物质结合，并能交换细胞表面的某些微生物生长所需要的阳离子（如Ｍｎ２＋、Ｃａ２＋、Ｍｏ２＋等），从而影响细胞结构的稳定性，对机体产生不利的影响。
目前关于壳聚糖的抗菌作用主要有２种机理［１０］：第１是壳聚糖通过吸附在细胞表面，形成一层高分子膜，阻止营养物质向细胞内的运输，从而起到抑菌杀菌作用；第２是壳聚糖通过渗透进入细胞体内，吸附细胞体内带有阴离子的细胞质，并发生絮凝作用，扰乱细胞正常的生理活动，从而杀灭细菌。这２种模型都可用来解释试验现象，高分子量壳聚糖和低分子量壳聚糖都对大肠杆菌有抑制作用，但其机理有所不同。高分子量壳聚糖主要遵循的是模型１；
而低分子量壳聚糖２种模型都起作用，故抑制作用较高分子量壳聚糖好。对于革兰氏阴性菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）来讲，后一种作用机理起主导作用，因为相对分子质量越小，越容易进入细胞壁的空隙结构内，从而干扰细胞的新陈代谢，杀死细菌。试验对大肠杆菌的研究结果显示，相对分子质量低的壳聚
糖的抑菌作用优于相对分子质量高的壳聚糖，此结果恰恰验证了壳聚糖对革兰氏阴性菌的作用机理，即质子化壳聚糖通过某种途径进入到菌体细胞内，吸附结合一些带负电的细胞质，扰乱菌体细胞的正常生理代谢，从而抑制细菌生长。分子质量相对低的壳聚糖的抑菌作用优于分子质量相对高的壳聚糖，是因为分子质量低的壳聚糖更有可能穿过菌体细胞膜而与细胞质发生作用。或者说，平均相对分子质量较低的壳聚糖，含有较多的能穿过细胞膜的小的壳聚糖，因而有较强的抑菌作用。之所以在壳聚糖的抑菌作用与其分子量的关系上的说法比较混乱，可能是因为壳聚糖是一种混合物，是由大分子量和小分子量的壳聚糖组合而成的，其分子量只是平均分子量。不同分子量的壳聚糖取决与其组成中大分子量和小分子量壳聚糖在混合物中所占的比例。最近的研究发现，壳聚糖的抗菌作用与具体的菌种有关，不能笼统而论。所以，如果能将壳聚糖进行比较彻底地分离，使其大分子和小分子分开，再探讨其抑菌规律及机理，也许会取得令人满意的结果。
４结论
壳聚糖对大肠杆菌具有较好的抑制作用，壳聚糖
分子量越小，其对大肠杆菌的抑制作用越好。
壳聚糖对大肠杆菌的抗菌作用与其氨基的质子化有关，即必须在酸性介质中才表现出抑菌作用。
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什么盛开
米曲霉沪酿3.042原生质体制备和再生的研究
李铁，臧威，刘井权，孙剑秋＊，肖静，张淑园，张兰兰
（齐齐哈尔大学生命科学与工程学院，黑龙江齐齐哈尔１６１００６）
摘要：研究了酶液组成、酶解温度、酶解时间、渗透压稳定剂、培养基成分、再生培养方式等因素对米曲霉沪酿３．０４２原生质体制备和再生的影响，建立了米曲霉沪酿３．０４２原生质体制备和再生的适宜方法，即在查氏液体培养基中２８℃培养１０ｈ，菌体用０．８ｍｏｌ／ＬＮａＣｌ配制的
３％溶壁酶、１％纤维素酶、１％蜗牛酶、０．５％溶菌酶的复合酶液，３０℃酶解４ｈ￣６ｈ后，经０．８ｍｏｌ／ＬＮａＣｌ再生固体培养基，双层平板培养法进行原生质体再生，可获得超过７０％的再生率。为进一步通过原生质体技术选育优良的酱制品生产用菌株奠定了方法学基础。
设若关键词：米曲霉沪酿３．０４２；原生质体；制备；再生
中图分类号：Ｑ８１３．１文献标识码：Ａ文章编号：２０５４－０５７１（２００７）０２－００１９－０４
ＰｒｏｔｏｐｌａｓｔｐｒｅｐａｒａｔｉｏｎａｎｄｒｅｇｅｎｅｒａｔｉｏｎｏｆＡｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓｏｒｙｚａｅ３．０４２ＬＩＴｉｅ，ＺＡＮＧＷｅｉ，ＬＩＵＪｉｎｇ－ｑｕａｎ，ＳＵＮＪｉａｎ－ｑｉｕ＊，ＸＩＡＯＪｉｎｇ，ＺＨＡＮＧＳｈｕ－ｙｕａｎ，ＺＨＡＮＧＬａｎ－ｌａｎ（ＣｏｌｌｅｇｅｏｆＬｉｆｅＳｃｉｅｎｃｅｓａｎｄＥｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ，ＱｉｑｉｈａｒＵｎｉｖｅｒｓｉｔｙ，Ｈｅｉｌｏｎｇｊｉａｎｇ１６１００６，Ｃｈｉｎａ）
Ａｂｓｔｒａｃｔ：ＴｈｅｆａｃｔｏｒｓａｆｆｅｃｔｉｎｇｐｒｏｔｏｐｌａｓｔｆｏｒｍａｔｉｏｎａｎｄｒｅｇｅｎｅｒａｔｉｏｎｏｆＡｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓｏｒｙｚａｅ３．０４２ｗｅｒｅｓｔｕｄｉｅｄｉｎｃｌｕｄｉｎｇｃｏｍｐｏｓｉｔｉｏｎｏｆｅｎ－ｚｙｍｅｍｉｘｔｕｒｅ，ｅｎｚｙｍｏｌｙｓｉｓｔｅｍｐｅｒａｔｕｒｅ，ｅｎｚｙｍｏｌｙｓｉｓｔｉｍｅ，ｏｓｍ
ｏｔｉｃｐｒｅｓｓｕｒｅｓｔａｂｉｌｉｚｅｒ，ｍｅｄｉｕｍｃｏｍｐｏｓｉｔｉｏｎ，ｃｕｌｔｕｒｅｍｅｔｈｏｄｓａｎｄｓｏｏｎ．Ｔｈｅａｐｐｒｏｐｒｉａｔｅｍｅｔｈｏｄｆｏｒｐｒｏｔｏｐｌａｓｔｆｏｒｍａｔｉｏｎａｎｄｒｅｇｅｎｅｒａｔｉｏｎｗｅｒｅｄｅｖｅｌｏｐｅｄ．Ａ．ｏｒｙｚａｅ３．０４２ｗａｓｃｕｌｔｕｒｅｄｉｎＣｚａｐｅｋｌｉｑｕｉｄｍｅｄｉｕｍｆｏｒ１０ｈ，ｔｈｅｎｔｈｅｍｙｃｅｌｉａｗｅｒｅｇａｔｈｅｒｅｄｂｙｃｅｎｔｒｉｆｕｇａｔｉｏｎａｎｄｄｉｇｅｓｔｅｄｂｙｅｎｚｙｍｅｍｉｘｔｕｒｅｃｏｎｓｉｓｔｉｎｇｏｆ０．８ｍｏｌ／ＬＮａＣｌ，３％ｌｙｗａｌｌｚｙｍｅ，１％ｃｅｌｌｕｌａｓｅ，１％ｓｎａｉｌａｓｅａｎｄ０．５％ｌｙｓｏｚｙｍｅａｔ３０℃ｆｏｒ４￣６ｈ，ｆｏｌｌｏｗｅｄｂｙｔｈｅｒｅｇｅｎｅｒａｔｉｏｎｏｎｓｏｌｉｄｍｅｄｉｕｍｃｏｎｔａｉｎｉｎｇ０．８ｍｏｌ／ＬＮａＣｌｂｙｄｏｕｂｌｅ－ｌａｙｅｒｓｃｕｌｔｉｖａｔｉｏｎ．Ａｒｅｇｅｎｅｒａｔｉｏｎｒａｔｅｏｆ７０％ｗａｓａｃｈｉｅｖｅｄ．Ｔｈｉｓｓｔｕｄｙｐｒｏｖｉｄｅｄａｎｅｗｍｅｔｈｏｄｔｏｓｃｒｅｅｎｇｏｏｄｓｔｒａｉｎｓｆｏｒｓａｕｃｅｐｒｏｄｕｃ－ｔｉｏｎｂｙｐｒｏｔｏｐｌａｓｔｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ．
Ｋｅｙｗｏｒｄｓ：Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓｏｒｙｚａｅ３．０４２；ｐｒｏｔｏｐｌａｓｔ；ｐｒｅｐａｒａｔｉｏｎ；ｒｅｇｅｎｅｒａｔｉｏｎ
收稿日期：２００６－０８－３０
基金项目：黑龙江省教育厅科学技术研究项目（１０５４１２５９）
作者简介：李铁（１９７３－），男，黑龙江齐齐哈尔人，实验师；孙剑秋＊，通讯作者。
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